青蒿琥酯對(duì)非酒精性脂肪炎大鼠肝組織中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白—1c表達(dá)的影響

陳晶+李麗+葉月芳

[摘要] 目的 探討青蒿琥酯對(duì)非酒精性脂肪性肝炎（NASH）大鼠肝組織過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（SREBP-1c）表達(dá)的影響。 方法 采用高脂飼料喂養(yǎng)的方法復(fù)制大鼠NASH模型，實(shí)驗(yàn)分正常組、模型組、易善復(fù)組、青蒿琥酯低劑量組、中劑量組和高劑量組。正常組每天予以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，正常組和模型組給予同等劑量的生理鹽水。給藥治療8周后，提取肝組織，運(yùn)用免疫組化方法測(cè)定各組大鼠肝組織PPARγ、SREBP-1c 蛋白表達(dá)情況；采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（MDA）含量；采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）含量；采用分光光度法測(cè)定谷胱甘肽-過(guò)氧化物酶（GSH-Px）含量；光鏡觀察肝脂肪變、炎癥及纖維化程度。 結(jié)果 與正常組相比，在模型組中不僅PPARγ蛋白表達(dá)（1.67±1.01）明顯減少，而且SREBP-1c蛋白表達(dá)（3.27±1.03）明顯增多（均P < 0.01）；青蒿琥酯低中劑量組與模型組相比，PPARγ蛋白表達(dá)增多，SREBP-1c蛋白表達(dá)明顯減少，并且呈劑量依賴性（均P < 0.05），青蒿琥酯高劑量組PPARγ為（3.21±1.02），SREBP-1c為（1.32±0.77），與模型組相比，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。與模型組相比，青蒿琥酯各劑量組能提高SOD和GSH-Px的含量，降低MDA的含量，并且呈劑量依賴性（均P < 0.05）；青蒿琥酯能明顯改善大鼠肝組織脂肪變、炎癥程度和肝纖維化程度。 結(jié)論 青蒿琥酯治療大鼠NASH的機(jī)制可能與上調(diào)PPARγ和下調(diào)SREBP-1c的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 青蒿琥酯；非酒精性脂肪性肝炎；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ；固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c

[中圖分類號(hào)] R575.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）08（b）-0004-04

Effects of artesunate on expressions of peroxisome proliferators activated receptor γ and sterol regulatory element binding protein-1c in the hepatic tissue of the rats with nonalcoholic steatohepatitis

CHEN Jing LI Li YE Yuefang

Department of Gastroenterology， the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University， Zhejiang Province， Hangzhou 310015， China

[Abstract] Objective To explore the influence of artesunate upon expressions of peroxisome proliferator-activated receptor γ （PPARγ） and sterol regulatory element binding protein-1c （SREBP-1c） in the hepatic tissue of the rats with nonalcoholic steatohepatitis （NASH）. Methods High-fat diets were used in male SD rats to induce NASH. Rats were divided into six groups： normal group， model group， Essentiale Forte N group， artesunate low-dose group， moderate-dose group and high-dose group. Standard feed was used to the normal group every day. Equal volume of normal saline was applied to the normal group and the model group. After artesunate treatment for 8 weeks， the hepatic tissues of the rats were extracted， and the expressions of PPARγ and SREBP-1c in them were detected by immunohistochemistry assay. The contents of malondialdehyde （MDA） was measured with thiobarbituric acid assay， the contents of superoxide dismutase （SOD） was measured by xanthine oxidase assay， and the contents of GSH-Px was measured by spectrophotometry. The presence of hepatic fatty degeneration and the degree of inflammation and fibrosis were observed with light microscope. Results Not noly the expression of PPARγ decreased （1.67±1.01） significantly but also the expression of SREBP-1c increased（3.27±1.03） significantly in the model group compared with those of the normal group （all P < 0.05）. The expression of PPARγ increased and the expression of SREBP-1c decreased in a dose-dependent manner in the artesunate low and moderate-dose groups compared with those of the model group. The expression of PPARγ was （3.21±1.02） and the expression of SREBP-1c was （1.32±0.77） in the artesunate high-dose group， which had significant differences compared to those of the model group （all P < 0.01）. In the artesunate groups， both the contents of SOD and GSH-Px increased and the content of MDA decreased in a dose-dependent manner compared to those of the model group. Both the fatty degeneration and the degree of inflammation and hepatic fibrosis in rats were improved markedly by artesunate. Conclusion The mechanism of artesunate curing rat NASH may be associated with the up-regulation of PPARγ expression and the down-regulation of SREBP-1c expression.

[Key words] Artesunate； Nonalcoholic steatohepatitis； Peroxisome proliferator-activated receptors γ； Sterol regulatory element binding protein-1c

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是世界范圍內(nèi)常見肝臟疾病之一，近年來(lái)在我國(guó)的發(fā)病率迅速上升，是繼病毒性肝炎后第2位常見肝病。NAFLD從病理上分為單純性脂肪肝、脂肪性肝炎（NASH）、脂肪性肝纖維化和脂肪性肝硬化[1]。因此，NAFLD是對(duì)人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅的慢性肝病之一，對(duì)NAFLD發(fā)病機(jī)制及防治方法的探討已經(jīng)成為當(dāng)前研究的核心，但其病理分子機(jī)制還不完全明確，故臨床治療上無(wú)特效藥物且療效欠佳。根據(jù)Day[2]提出的“二次打擊學(xué)說(shuō)”，本實(shí)驗(yàn)擬從其發(fā)病機(jī)制出發(fā)，研究過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（SREBP-1c）在脂肪代謝中的調(diào)節(jié)作用，初步探討青蒿琥酯對(duì)NASH的保護(hù)作用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Leica2235輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國(guó)），Biofuge 28RS低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Heraeus公司），OlympasB41顯微鏡（日本Olympas），生物安全柜（Thermo scienrific，1384），數(shù)顯立式高壓滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司，YXQ-LS-30SⅡ），低溫冰箱（Thermo scientific，MDF-U538-C）和純化水制水系統(tǒng)（象山和信制藥設(shè)備有限公司，F(xiàn)ST-2B型）。

1.2 試藥

青蒿琥酯（廣西桂林制藥二廠，批號(hào)：010901）、易善復(fù)（賽諾菲安萬(wàn)特制藥有限公司，批號(hào)：D1157），丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽-過(guò)氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為：A001-2，ba8150，20100107）。SREBP1兔抗（Santa Cruz Biotechnology，批號(hào)：C0907）；Envision二步法免疫組化試劑盒（丹麥Dako公司，批號(hào)：00029661）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物許可證號(hào)SCXK浙-20080033）。大鼠普通飼料及高脂飼料由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心加工生產(chǎn)，高脂飼料配方為：普通飼料82%、蛋黃粉5%、豬油10%、膽固醇2%、膽鹽1%。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

95只SD大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組15只（每天予以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)），造模組80只（每天予以高脂飼料喂養(yǎng)），連續(xù)喂養(yǎng)12周；第12周結(jié)束后隨機(jī)在造模組中處死5只。取肝臟進(jìn)行病理切片檢查HE染色法，評(píng)定非酒精性脂肪性肝炎程度，對(duì)已成模的大鼠分成5組，每組15只，分別是模型組、易善復(fù)組、青蒿琥酯低、中和高劑量組；青蒿琥酯低、中和高劑量組青蒿琥酯分別按5、15、45 mg/g劑量每日灌胃；易善復(fù)組給予易善復(fù)按300 mg/g劑量每日灌胃；正常組和模型組給予同等劑量的生理鹽水，給藥治療8周后，處死各組大鼠，迅速取肝右葉中部切取數(shù)塊肝組織，立即投入液氮中凍存，3 h后移入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 各組大鼠肝組織MDA、SOD和GSH-Px含量測(cè)定

過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰。取各組動(dòng)物血清，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作，稀釋倍數(shù)為1倍，上樣量為10 μL，MDA含量公式為：血清中MDA的含量（nmol/mL）=÷標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10 nmol/mL）+樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

通過(guò)黃嘌呤和XOD反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生O2-，O2-氧化羥胺形成亞硝酸鹽（NO2-），同時(shí)在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，測(cè)定其吸光度。通過(guò)公式計(jì)算出被測(cè)樣品中SOD活力：血漿中總SOD活力（U/mL）=÷50%×反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)×樣本測(cè)試前。

根據(jù)酶促反應(yīng)中谷胱甘肽（GSH）的消耗，可以求出酶的活力（H2O2+2GSH2H2O+GSSG），然后取各組動(dòng)物血清，嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作，稀釋倍數(shù)為30倍，通過(guò)公式測(cè)定血清中GSH-PX含量。公式為：血清GSH-Px活力（U/mL）=×標(biāo)準(zhǔn)管濃度（20 μmol/L）×稀釋倍數(shù)（6）×樣本測(cè)試前的稀釋倍數(shù)。

2.3肝組織病理

常規(guī)HE染色觀察肝組織脂肪變、炎癥及纖維化程度。病理診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組2006年2月修訂的《酒精性肝病診療指南》[3]。

2.4肝組織免疫組化

取上述石蠟標(biāo)本切片，采用免疫組化二步法進(jìn)行免疫組化染色。每張切片于陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域選擇10個(gè)無(wú)重疊視野，陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿或胞核呈棕黃色顆粒。著色細(xì)胞陽(yáng)性范圍：無(wú)著色為0分，著色陽(yáng)性細(xì)胞小于1/3為1分，著色陽(yáng)性細(xì)胞1/3～1/2為2分，著色陽(yáng)性細(xì)胞大于1/2為3分；將每張切片著色程度與著色細(xì)胞陽(yáng)性范圍得分各自相加取平均值為其最后計(jì)分。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肝組織MDA、SOD和GSH-Px含量測(cè)定結(jié)果

與正常組相比，模型組大鼠肝組織MDA顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與模型組比較，青蒿琥酯各劑量組大鼠肝組織MDA顯著下降并且呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與正常組比較，模型組大鼠肝組織SOD和GSH-Px顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與模型組比較，青蒿琥酯各劑量組大鼠肝組織SOD和GSH-Px顯著增加并且呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。結(jié)果見表1。

3.2 各組大鼠肝臟組織HE染色結(jié)果

光鏡下，正常組大鼠肝臟肝小葉輪廓清晰，結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞索排列整齊，肝細(xì)胞呈無(wú)明顯病變，核結(jié)構(gòu)清晰。模型組大鼠肝組織可見中到重度脂肪肝，肝索出現(xiàn)紊亂，胞質(zhì)疏松可見大小不一的脂滴空泡，肝小葉內(nèi)出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死，匯管區(qū)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；青蒿琥酯組可見輕度到中度脂肪變，細(xì)胞腫脹，胞漿內(nèi)可見大小不等的脂肪空泡，肝小葉未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見封三（圖1）。

3.3各組大鼠肝臟組織免疫組化結(jié)果

采用免疫組化二步法進(jìn)行免疫組化染色，PPARγ主要定位于肝細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色顆粒主要分布在匯管區(qū)周圍肝細(xì)胞胞核內(nèi)；與正常組相比，模型組PPARγ陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞明顯減少（P < 0.05）；青蒿琥酯中、低劑量組與模型組相比，PPARγ陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞增多，并且呈劑量依賴性（均P < 0.05），青蒿琥酯高劑量組和模型組相比差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；SREBP-1c 表達(dá)于胞漿質(zhì)中，可見肝細(xì)胞質(zhì)中散在分布淺黃色顆；與正常組相比，模型組SREBP-1c陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞質(zhì)中可見大量棕褐色顆粒沉積，同時(shí)大部分細(xì)胞核也呈陽(yáng)性著色，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；青蒿琥酯中、低劑量組與模型組相比，SREBP-1c陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞減少，并且呈劑量依賴性減少，青蒿琥酯高劑量組和模型組相比差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見封三（圖2、3），表2。4 討論

青蒿素是從植物黃花蒿中提取得到的一種內(nèi)酯化合物。青蒿素及其衍生物具有抗病毒、抗腫瘤和免疫抑制等多方面藥理作用。青蒿琥酯為青蒿素水溶性的衍生物[4]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯對(duì)醋氨酚（AAP）與四氯化碳（CCl4）引起的小鼠急性肝損傷有保護(hù)作用[5-6]；來(lái)麗娜等[4]發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能降低牛血清白蛋白致大鼠肝纖維化程度。因此，本實(shí)驗(yàn)初步探討青蒿琥酯是否能通過(guò)PPARγ和SREBP-1c途徑阻斷NASH的形成。

氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過(guò)氧化是“二次打擊”學(xué)說(shuō)的核心環(huán)節(jié)。正常情況下肝線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在脂肪酸β氧化過(guò)程中產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），使氧化和抗氧化處于動(dòng)態(tài)平衡。在病理情況下，肝細(xì)胞內(nèi)一旦ROS的過(guò)量產(chǎn)生與抗氧化能力降低，能促使氧化物與抗氧化物之間的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，很容易導(dǎo)致氧化應(yīng)激狀態(tài)[7]。SOD是體內(nèi)一種重要的自由基清除劑，能夠平衡機(jī)體的ROS，避免超氧陰離子自由基濃度過(guò)高時(shí)引起的不良反應(yīng)。脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA可形成蛋白加合物，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體介導(dǎo)的免疫損傷[8]。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)存在的一種含硒抗氧化酶，它能特異性地催化GSH對(duì)H2O2的還原反應(yīng)，進(jìn)而清除H2O2，從而起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。如果過(guò)氧化氫酶（CAT）在肝臟中含量極高，可以促使H2O2分解為分子氧和水，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的損害[9]。因此，提高SOD、GSH-Px活性與降低肝MDA含量對(duì)抗氧應(yīng)激狀態(tài)，提高肝臟抗氧化能力。本研究結(jié)果表明青蒿琥酯可通過(guò)增加機(jī)體SOD和GSH-Px活性，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，加速自由基的清除，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，清除過(guò)量的MDA，從而保護(hù)肝臟的結(jié)構(gòu)和功能。

PPAR有3種亞型分別為α、β、γ，其中PPARγ是由多種脂肪酸及其衍生物激活，是胰島素細(xì)胞間信號(hào)傳遞和脂肪細(xì)胞基因表達(dá)的主要調(diào)控者，參與了脂代謝的調(diào)節(jié)及脂肪細(xì)胞分化，因此在NAFLD中起著重要作用[10]。SREBPs是一類膜連接蛋白，其位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。SREBP-1也是一種核轉(zhuǎn)錄因子，SREBP-1c是其中一個(gè)亞型，它主要參與糖代謝和脂肪酸的代謝，是脂肪合成基因轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)節(jié)因子，與脂肪變性有密切聯(lián)系[11]。本實(shí)驗(yàn)從蛋白水平結(jié)果顯示：PRARγ和SREBP-lc與肝細(xì)胞病變程度有很好的一致性關(guān)系，兩者可能協(xié)同作用參與并促進(jìn)了非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步驗(yàn)證青蒿琥酯抑制PRARγ和SREBP-lc的不適當(dāng)表達(dá)可能是預(yù)防和治療NASH的一條有效途徑。

[參考文獻(xiàn)]

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[3] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.酒精性肝病診療指南[J].中華肝臟病雜志，2006，14（3）：164-166.

[4] 來(lái)麗娜，任澤恩，宋曉亮，等.青蒿琥酯對(duì)肝纖維化大鼠肝臟基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達(dá)的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（11）：264-267.

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（收稿日期：2014-04-30 本文編輯：衛(wèi) 軻）

3.2 各組大鼠肝臟組織HE染色結(jié)果

光鏡下，正常組大鼠肝臟肝小葉輪廓清晰，結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞索排列整齊，肝細(xì)胞呈無(wú)明顯病變，核結(jié)構(gòu)清晰。模型組大鼠肝組織可見中到重度脂肪肝，肝索出現(xiàn)紊亂，胞質(zhì)疏松可見大小不一的脂滴空泡，肝小葉內(nèi)出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死，匯管區(qū)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；青蒿琥酯組可見輕度到中度脂肪變，細(xì)胞腫脹，胞漿內(nèi)可見大小不等的脂肪空泡，肝小葉未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見封三（圖1）。

3.3各組大鼠肝臟組織免疫組化結(jié)果

采用免疫組化二步法進(jìn)行免疫組化染色，PPARγ主要定位于肝細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色顆粒主要分布在匯管區(qū)周圍肝細(xì)胞胞核內(nèi)；與正常組相比，模型組PPARγ陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞明顯減少（P < 0.05）；青蒿琥酯中、低劑量組與模型組相比，PPARγ陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞增多，并且呈劑量依賴性（均P < 0.05），青蒿琥酯高劑量組和模型組相比差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；SREBP-1c 表達(dá)于胞漿質(zhì)中，可見肝細(xì)胞質(zhì)中散在分布淺黃色顆；與正常組相比，模型組SREBP-1c陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞質(zhì)中可見大量棕褐色顆粒沉積，同時(shí)大部分細(xì)胞核也呈陽(yáng)性著色，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；青蒿琥酯中、低劑量組與模型組相比，SREBP-1c陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞減少，并且呈劑量依賴性減少，青蒿琥酯高劑量組和模型組相比差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見封三（圖2、3），表2。4 討論

青蒿素是從植物黃花蒿中提取得到的一種內(nèi)酯化合物。青蒿素及其衍生物具有抗病毒、抗腫瘤和免疫抑制等多方面藥理作用。青蒿琥酯為青蒿素水溶性的衍生物[4]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯對(duì)醋氨酚（AAP）與四氯化碳（CCl4）引起的小鼠急性肝損傷有保護(hù)作用[5-6]；來(lái)麗娜等[4]發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能降低牛血清白蛋白致大鼠肝纖維化程度。因此，本實(shí)驗(yàn)初步探討青蒿琥酯是否能通過(guò)PPARγ和SREBP-1c途徑阻斷NASH的形成。

氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過(guò)氧化是“二次打擊”學(xué)說(shuō)的核心環(huán)節(jié)。正常情況下肝線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在脂肪酸β氧化過(guò)程中產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），使氧化和抗氧化處于動(dòng)態(tài)平衡。在病理情況下，肝細(xì)胞內(nèi)一旦ROS的過(guò)量產(chǎn)生與抗氧化能力降低，能促使氧化物與抗氧化物之間的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，很容易導(dǎo)致氧化應(yīng)激狀態(tài)[7]。SOD是體內(nèi)一種重要的自由基清除劑，能夠平衡機(jī)體的ROS，避免超氧陰離子自由基濃度過(guò)高時(shí)引起的不良反應(yīng)。脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA可形成蛋白加合物，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體介導(dǎo)的免疫損傷[8]。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)存在的一種含硒抗氧化酶，它能特異性地催化GSH對(duì)H2O2的還原反應(yīng)，進(jìn)而清除H2O2，從而起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。如果過(guò)氧化氫酶（CAT）在肝臟中含量極高，可以促使H2O2分解為分子氧和水，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的損害[9]。因此，提高SOD、GSH-Px活性與降低肝MDA含量對(duì)抗氧應(yīng)激狀態(tài)，提高肝臟抗氧化能力。本研究結(jié)果表明青蒿琥酯可通過(guò)增加機(jī)體SOD和GSH-Px活性，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，加速自由基的清除，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，清除過(guò)量的MDA，從而保護(hù)肝臟的結(jié)構(gòu)和功能。

PPAR有3種亞型分別為α、β、γ，其中PPARγ是由多種脂肪酸及其衍生物激活，是胰島素細(xì)胞間信號(hào)傳遞和脂肪細(xì)胞基因表達(dá)的主要調(diào)控者，參與了脂代謝的調(diào)節(jié)及脂肪細(xì)胞分化，因此在NAFLD中起著重要作用[10]。SREBPs是一類膜連接蛋白，其位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。SREBP-1也是一種核轉(zhuǎn)錄因子，SREBP-1c是其中一個(gè)亞型，它主要參與糖代謝和脂肪酸的代謝，是脂肪合成基因轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)節(jié)因子，與脂肪變性有密切聯(lián)系[11]。本實(shí)驗(yàn)從蛋白水平結(jié)果顯示：PRARγ和SREBP-lc與肝細(xì)胞病變程度有很好的一致性關(guān)系，兩者可能協(xié)同作用參與并促進(jìn)了非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步驗(yàn)證青蒿琥酯抑制PRARγ和SREBP-lc的不適當(dāng)表達(dá)可能是預(yù)防和治療NASH的一條有效途徑。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Duvnjak M，Leroti I，Barsi N，et al. Pathogenesis and managementissues for nonalcoholic fatty liver disease [J]. World J Gastroenterol，2007，1（3）：4539-4550.

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[4] 來(lái)麗娜，任澤恩，宋曉亮，等.青蒿琥酯對(duì)肝纖維化大鼠肝臟基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達(dá)的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（11）：264-267.

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[7] 鄭海音，趙錦燕，劉艷，等.粗葉懸鉤子總生物堿對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝病的抗氧化作用研究[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36（17）：2383-2387.

[8] 王一平，譚華炳，王記紅，等.非酒精性脂肪性肝病兔肝組織甘油三酯、丙二醛、超氧化物歧化酶與血漿內(nèi)皮素的關(guān)系[J].中華臨床醫(yī)師雜志，2011，5（4）：971-974.

[9] 王晶宇，馬笑燕，夏苗，等.藏藥柳茶提取物對(duì)非酒精性脂肪肝病大鼠肝臟保護(hù)作用及其機(jī)制研究[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2011，27（3）：191-194.

[10] Mcirhacghc A，F(xiàn)ajas I，Gouilleux F，et al. A functional polymorphism in a STA5B site of human PPAR gamma 3 gene promoter affects height and lipid metabolism in a French population [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23（2）：289.

[11] Shimomura I，Shimano H，Horton JD，et al. Differential expression of exons la and lc in Mrna for sterol regulatory element binding protein-1 in human and moumse organs and cultured cells [J]. J Clin Invest，1997，9（9）：838.

（收稿日期：2014-04-30 本文編輯：衛(wèi) 軻）

3.2 各組大鼠肝臟組織HE染色結(jié)果

光鏡下，正常組大鼠肝臟肝小葉輪廓清晰，結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞索排列整齊，肝細(xì)胞呈無(wú)明顯病變，核結(jié)構(gòu)清晰。模型組大鼠肝組織可見中到重度脂肪肝，肝索出現(xiàn)紊亂，胞質(zhì)疏松可見大小不一的脂滴空泡，肝小葉內(nèi)出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死，匯管區(qū)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；青蒿琥酯組可見輕度到中度脂肪變，細(xì)胞腫脹，胞漿內(nèi)可見大小不等的脂肪空泡，肝小葉未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見封三（圖1）。

3.3各組大鼠肝臟組織免疫組化結(jié)果

采用免疫組化二步法進(jìn)行免疫組化染色，PPARγ主要定位于肝細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色顆粒主要分布在匯管區(qū)周圍肝細(xì)胞胞核內(nèi)；與正常組相比，模型組PPARγ陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞明顯減少（P < 0.05）；青蒿琥酯中、低劑量組與模型組相比，PPARγ陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞增多，并且呈劑量依賴性（均P < 0.05），青蒿琥酯高劑量組和模型組相比差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；SREBP-1c 表達(dá)于胞漿質(zhì)中，可見肝細(xì)胞質(zhì)中散在分布淺黃色顆；與正常組相比，模型組SREBP-1c陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞質(zhì)中可見大量棕褐色顆粒沉積，同時(shí)大部分細(xì)胞核也呈陽(yáng)性著色，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；青蒿琥酯中、低劑量組與模型組相比，SREBP-1c陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞減少，并且呈劑量依賴性減少，青蒿琥酯高劑量組和模型組相比差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見封三（圖2、3），表2。4 討論

青蒿素是從植物黃花蒿中提取得到的一種內(nèi)酯化合物。青蒿素及其衍生物具有抗病毒、抗腫瘤和免疫抑制等多方面藥理作用。青蒿琥酯為青蒿素水溶性的衍生物[4]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯對(duì)醋氨酚（AAP）與四氯化碳（CCl4）引起的小鼠急性肝損傷有保護(hù)作用[5-6]；來(lái)麗娜等[4]發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能降低牛血清白蛋白致大鼠肝纖維化程度。因此，本實(shí)驗(yàn)初步探討青蒿琥酯是否能通過(guò)PPARγ和SREBP-1c途徑阻斷NASH的形成。

氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過(guò)氧化是“二次打擊”學(xué)說(shuō)的核心環(huán)節(jié)。正常情況下肝線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在脂肪酸β氧化過(guò)程中產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），使氧化和抗氧化處于動(dòng)態(tài)平衡。在病理情況下，肝細(xì)胞內(nèi)一旦ROS的過(guò)量產(chǎn)生與抗氧化能力降低，能促使氧化物與抗氧化物之間的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，很容易導(dǎo)致氧化應(yīng)激狀態(tài)[7]。SOD是體內(nèi)一種重要的自由基清除劑，能夠平衡機(jī)體的ROS，避免超氧陰離子自由基濃度過(guò)高時(shí)引起的不良反應(yīng)。脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA可形成蛋白加合物，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體介導(dǎo)的免疫損傷[8]。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)存在的一種含硒抗氧化酶，它能特異性地催化GSH對(duì)H2O2的還原反應(yīng)，進(jìn)而清除H2O2，從而起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。如果過(guò)氧化氫酶（CAT）在肝臟中含量極高，可以促使H2O2分解為分子氧和水，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的損害[9]。因此，提高SOD、GSH-Px活性與降低肝MDA含量對(duì)抗氧應(yīng)激狀態(tài)，提高肝臟抗氧化能力。本研究結(jié)果表明青蒿琥酯可通過(guò)增加機(jī)體SOD和GSH-Px活性，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，加速自由基的清除，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，清除過(guò)量的MDA，從而保護(hù)肝臟的結(jié)構(gòu)和功能。

PPAR有3種亞型分別為α、β、γ，其中PPARγ是由多種脂肪酸及其衍生物激活，是胰島素細(xì)胞間信號(hào)傳遞和脂肪細(xì)胞基因表達(dá)的主要調(diào)控者，參與了脂代謝的調(diào)節(jié)及脂肪細(xì)胞分化，因此在NAFLD中起著重要作用[10]。SREBPs是一類膜連接蛋白，其位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。SREBP-1也是一種核轉(zhuǎn)錄因子，SREBP-1c是其中一個(gè)亞型，它主要參與糖代謝和脂肪酸的代謝，是脂肪合成基因轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)節(jié)因子，與脂肪變性有密切聯(lián)系[11]。本實(shí)驗(yàn)從蛋白水平結(jié)果顯示：PRARγ和SREBP-lc與肝細(xì)胞病變程度有很好的一致性關(guān)系，兩者可能協(xié)同作用參與并促進(jìn)了非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步驗(yàn)證青蒿琥酯抑制PRARγ和SREBP-lc的不適當(dāng)表達(dá)可能是預(yù)防和治療NASH的一條有效途徑。

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[4] 來(lái)麗娜，任澤恩，宋曉亮，等.青蒿琥酯對(duì)肝纖維化大鼠肝臟基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達(dá)的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（11）：264-267.

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[7] 鄭海音，趙錦燕，劉艷，等.粗葉懸鉤子總生物堿對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝病的抗氧化作用研究[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36（17）：2383-2387.

[8] 王一平，譚華炳，王記紅，等.非酒精性脂肪性肝病兔肝組織甘油三酯、丙二醛、超氧化物歧化酶與血漿內(nèi)皮素的關(guān)系[J].中華臨床醫(yī)師雜志，2011，5（4）：971-974.

[9] 王晶宇，馬笑燕，夏苗，等.藏藥柳茶提取物對(duì)非酒精性脂肪肝病大鼠肝臟保護(hù)作用及其機(jī)制研究[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2011，27（3）：191-194.

[10] Mcirhacghc A，F(xiàn)ajas I，Gouilleux F，et al. A functional polymorphism in a STA5B site of human PPAR gamma 3 gene promoter affects height and lipid metabolism in a French population [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23（2）：289.

[11] Shimomura I，Shimano H，Horton JD，et al. Differential expression of exons la and lc in Mrna for sterol regulatory element binding protein-1 in human and moumse organs and cultured cells [J]. J Clin Invest，1997，9（9）：838.

（收稿日期：2014-04-30 本文編輯：衛(wèi) 軻）