重組豬源胰蛋白酶原的構(gòu)建、表達與活性分析

馮雪婷，劉素麗，黃瀟，王云康，龍軍，金亮，曹榮月*

（1. 中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京210009；2. 江蘇未名生物醫(yī)藥有限公司，江蘇 常州 213000 ；3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210046）

·藥學(xué)研究·
PHARMACEUTICAL RESEARCH

重組豬源胰蛋白酶原的構(gòu)建、表達與活性分析

馮雪婷1,2，劉素麗2，黃瀟2，王云康1，龍軍3，金亮1，曹榮月1*

（1. 中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京210009；2. 江蘇未名生物醫(yī)藥有限公司，江蘇 常州 213000 ；3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210046）

目的：構(gòu)建、表達重組豬源胰蛋白酶原，并對其進行分離純化和酶活性分析。方法：利用大腸埃希菌表達系統(tǒng)（pET-28a，宿主菌BL21 DE3）優(yōu)化天然豬源胰蛋白酶原基因，經(jīng)乳糖誘導(dǎo)表達重組胰蛋白酶原蛋白，采用陰離子交換色譜法分離純化，以SDS-PAGE電泳鑒定目標(biāo)蛋白，以紫外分光光度法檢測重組蛋白的酶活力。結(jié)果：測序結(jié)果表明，重組豬源胰蛋白酶原基因工程菌構(gòu)建成功，SDS-PAGE檢測顯示目的蛋白條帶位置與標(biāo)準(zhǔn)豬源胰蛋白酶條帶位置一致，且酶活力可達513.09 U?mg-1。結(jié)論：成功獲得了重組豬源胰蛋白酶原，且酶活力較好，為進一步研究生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。

豬源胰蛋白酶原基因；包涵體變性；乳糖誘導(dǎo)；稀釋復(fù)性

胰蛋白酶(trypsin，EC3.4.21.4)屬于絲氨酸蛋白酶的一種，在胰臟中以胰蛋白酶原的前體形式被合成和分泌。胰蛋白酶原與胰蛋白酶的結(jié)構(gòu)中均存在一個對Ca2+高度親和的部位，其對胰蛋白酶原的激活及胰蛋白酶活性狀態(tài)的保持非常重要[1]。在Ca2+的存在下，胰蛋白酶原被腸激酶或有活性的胰蛋白酶激活，形成活化胰蛋白酶[2]，后者作為肽鏈內(nèi)切酶，對多肽鏈中賴氨酸或精氨酸羧基所形成的肽鍵呈高度專一性，可水解該肽鍵產(chǎn)生以堿性氨基酸為羧基末端的小分子肽。

胰蛋白酶可作為添加劑，用于表面黏附細(xì)胞的脫壁，流感病毒疫苗、胰島素和其他蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，蛋白的快速水解以及動物細(xì)胞組織的前處理等，故市場上對純度高、活性強的胰蛋白酶需求量較大。但在制備胰蛋白酶的傳統(tǒng)方法中，由于動物胰腺的個體差異，特別是胰腺中脂肪含量嚴(yán)重影響酶活力以及酶的活化和純化，故每批的活性胰蛋白酶收率存在差異[3]，且分離純化不徹底所帶來的雜質(zhì)（如糜蛋白酶）會對胰蛋白酶特異性切割賴氨酸和精氨酸的位點產(chǎn)生影響。同時，傳統(tǒng)制備方法中分離純化的步驟多、時間長，易對蛋白造成破壞以致失活，導(dǎo)致產(chǎn)率偏低。因此，胰蛋白酶的制備生產(chǎn)，已逐步由從動物胰臟中提取向重組表達生產(chǎn)過渡。通過構(gòu)建重組豬源胰蛋白酶原的大腸埃希菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)胰蛋白酶，還可避免因供體動物源性所致相關(guān)病原體污染以及攜帶未知病毒的風(fēng)險。

豬源胰蛋白酶原相對分子質(zhì)量約為24 000，按等電點不同，豬源胰蛋白酶原可分為陰離子型（pI ＜ 6.8）和陽離子型（pI ＞ 6.8）[4]。因陽離子型不僅比重較大，且穩(wěn)定性優(yōu)于陰離子型，故選擇陽離子型豬源胰蛋白酶原進行構(gòu)建、表達[5]。豬源胰蛋白酶原含有12個半胱氨酸，可形成6對二硫鍵[6]（30-160、48-64、132-233、139-206、171-185、196-220），這極大地增加了后續(xù)實驗中包涵體變性與復(fù)性的難度。同時，豬源胰蛋白酶性質(zhì)不穩(wěn)定，易發(fā)生自溶作用[7]，在選擇構(gòu)建重組豬胰蛋白酶原表達系統(tǒng)時，該自溶特性使真核表達系統(tǒng)很難獲得完整的胰蛋白酶原，且活化后產(chǎn)物對宿主細(xì)胞也會產(chǎn)生毒性[8]，故考慮選擇原核表達系統(tǒng)[9-10]。此外，該自溶特性要求豬源胰蛋白酶原的激活條件也需嚴(yán)格控制。本研究利用大腸埃希菌表達系統(tǒng)（pET-28a，宿主菌BL21 DE3），初步確立了重組豬源胰蛋白酶原的制備工藝，所得重組豬源胰蛋白酶的酶活力較好，且不含其他動物源污染，為工業(yè)化研究生產(chǎn)提供了一定的實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

DYCP-31C型電泳槽（北京市六一儀器廠）；WD-9403型紫外分析儀（北京六一儀器廠）；5W-CJ-IB型凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）；HDJ-2B型核酸蛋白檢測儀（南京普陽科學(xué)儀器研究所）；0.2 m2中型切向流超濾交換機（美國密理博公司）；AKTA Prime plus（美國通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)有限公司）。

1.2 質(zhì)粒與菌株

含有pro-Tg基因的表達載體pET-28a為本實驗室構(gòu)建；大腸埃希菌E.coli DH5α、表達宿主菌E.coli BL21（DE3）為本實驗室保存。

1.3 酶與試劑

分子克隆工具酶，質(zhì)粒抽提試劑盒，PCR產(chǎn)物回收試劑盒，甘氨酸，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE），標(biāo)準(zhǔn)豬源胰蛋白酶（上海生工生物工程有限公司）；硫代乙醇酸鈉（β-ME），瓊脂粉，氯化鈉，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)胰島素（Lilly France公司，100 IU·mL-1）；胰島素原為實驗室自備（濃度為1 g·L-1）；豬源胰蛋白酶原基因合成、引物合成、基因測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 重組豬源胰蛋白酶原基因工程菌的構(gòu)建

在NCBI基因庫中提取天然豬源胰蛋白酶原基因序列(LOC100302368)，分析基因中含有的大腸埃希菌表達系統(tǒng)的稀有密碼子，且在不改變目的蛋白氨基酸序列的前提下將稀有密碼子替換為大腸埃希菌表達系統(tǒng)偏愛密碼子，并于5’端添加一個NdeⅠ酶切位點、3’端添加一個NcoⅠ酶切位點。通過基因合成，獲得pro-Tg基因以平末端的方式連接在pUC57載體上。經(jīng)NdeⅠ和NcoⅠ雙酶切得到目的片段，以T4DNA連接酶連接到具有相同雙酶切位點的表達載體pET28a上，14 ℃過夜反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌E.coli DH5α，利用卡那霉素抗性篩選陽性克隆。提取質(zhì)粒進行NdeⅠ、NcoⅠ雙酶切及pvuⅡ單酶切鑒定，以及測序和序列分析。提取重組表達質(zhì)粒pET28a- pro-Tg轉(zhuǎn)化表達在宿主菌E.coli BL21（DE3）中，構(gòu)建基因工程菌株。

2.2 重組表達質(zhì)粒pET28a- pro-Tg的誘導(dǎo)表達

將pET28a-pro-Tg/BL21（DE3）重組基因工程菌接種至含50 μg·mL-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃活化16 h，按1%的比例轉(zhuǎn)接至含50 μg·mL-1卡那霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，于33 ℃、220 r·min-1條件振蕩培養(yǎng)3.5 h后，加入乳糖使其終濃度為5 mmol·L-1，培養(yǎng)24 h，經(jīng)乳糖誘導(dǎo)表達重組胰蛋白酶原蛋白。

菌液于4 ℃、8 000 r·min-1離心30 min，取少量培養(yǎng)基上清液后留樣；收集菌體沉淀，經(jīng)高壓破碎后4 ℃、8 000 r·min-1離心30 min，取上清液與沉淀留樣，作14% SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達情況。

2.3 重組豬源胰蛋白酶原的包涵體變性與復(fù)性

2.3.1 重組豬源胰蛋白酶原的包涵體的獲得 菌液于4 ℃、8 000 r·min-1離心15 min收集菌體。將菌體重懸于菌體破碎緩沖液（4 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1Gly-NaOH，pH 8.0～9.0）中室溫攪拌1 h。以高壓勻漿方式破碎菌體，再于4 ℃、8000 r·min-1離心30 min，棄去上清液，沉淀物重懸于破碎洗滌液（2 mmol·L-1EDTA，25 mmol·L-1Gly-NaOH，pH 8.5）中，室溫攪拌2 h。最后于4 ℃、8 000 r·min-1離心30 min，得包涵體沉淀。

2.3.2 重組豬源胰蛋白酶原包涵體的溶解變性 將30 g（濕重）包涵體加至1 L尿素裂解緩沖液（50 mmol·L-1Gly-NaOH，8 mol·L-1Urea，pH 10.5）中，待包涵體重懸后，邊攪拌（轉(zhuǎn)速200 r·min-1）邊勻速通N2以充分置換溶液中O2， 10 min后加入10 mmol·L-1β-ME作還原劑，25 ℃、200 r·min-1攪拌16 h，最后于25 ℃、8 000 r·min-1離心30 min，收集上清液。

2.3.3 重組豬源胰蛋白酶原包涵體的稀釋復(fù)性 按V變性上清液︰V復(fù)性液=1︰30逐滴加入復(fù)性緩沖液（5 mmol·L-1Gly-NaOH，GSH和GSSG比例為1︰0.8，pH 8.0）并緩慢攪拌，使蛋白終濃度為0.2 g·L-1，于8 ℃靜置復(fù)性24 h后，作超濾濃縮7倍（體積比），并置換緩沖液（5 mmol·L-1Gly-NaOH， pH 8.0）。

2.4 重組豬源胰蛋白酶原的活化

取濃縮復(fù)性液按W復(fù)性液中蛋白量︰W標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶=400︰1添加標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶作酶切，酶切條件為0.5 mmol·L-1Ca2+、pH 8.0、溫度25 ℃、時間16 h。

2.5 重組豬源胰蛋白酶的分離純化

選用DEAE-FF陰離子交換柱，以 5 mmol·L-1Gly-NaOH、pH 9.0的緩沖液平衡至基線平穩(wěn)，將經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶處理后的復(fù)性液緩慢連續(xù)上樣，用相同的緩沖液平衡至基線平穩(wěn)后，分別用10 mmol·L-1、80 mmol·L-1NaCl鹽溶液（含5 mmol·L-1Gly-NaOH，pH 8.0）進行階段洗脫。收集的樣品進行14% SDSPAGE檢測純化結(jié)果并進行活力測定。

2.6 重組豬源胰蛋白酶的活力測定

參照《中國藥典》[11]，以含0.0025 mol·L-1BAEE為測活底物溶液（每10 mL 0.0025 mol·L-1BAEE，加入按 V0.067mol·L-1磷酸二氫鉀︰ V0.067mol·L-1磷酸氫二鈉=13︰87混合的磷酸鹽緩沖液，稀釋定容至100 mL，pH 7.6）。取3 mL上述底物溶液置于1 cm的石英比色杯中，在25 ℃環(huán)境中，將以0.001 mol·L-1HCl稀釋過的酶溶液加至底物中，用紫外分光光度法檢測5 min內(nèi)在254 nm處吸光度的變化。

式中：△A253nm為T分鐘內(nèi)光吸收值的差值；

T為測定時間（min）；

V為加入的樣品酶溶液的體積（mL）；

W為測定液中含供試品的量（mg）；

0.003 為在上述條件下，吸光度每分鐘改變0.003，即相當(dāng)于1個胰蛋白酶單位。

2.7 重組豬源胰蛋白酶切割胰島素原

取定量胰島素原復(fù)性液，以重組豬源胰蛋白酶（濃度為0.392 g·L-1）為實驗組、標(biāo)準(zhǔn)豬源胰蛋白酶(濃度為 1 g·L-1)為對照組，按 W復(fù)性液中胰島素原蛋白量︰W胰蛋白酶蛋白量=3000︰1進行酶切反應(yīng)。其他反應(yīng)條件為：CPB 添加量按W復(fù)性液中胰島素原蛋白量︰WCPB量=2000︰1、10 mmol·L-1CaCl2、10 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1Gly-NaOH 、pH 8.0、時間16 h、溫度4 ℃。酶切反應(yīng)完畢后用1 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH至2～3終止反應(yīng)，HPLC檢測實驗組、對照組的酶切結(jié)果(HPLC進樣量均為2μL)。

3 結(jié)果

3.1 重組表達質(zhì)粒pET28a- pro-Tg的構(gòu)建及序列測定

將通過基因合成連接在pUC57載體上的pro-Tg基因進行NdeⅠ、NcoⅠ雙酶切，得到目的片段，再對表達載體pET28a進行相同雙酶切得到載體片段，最后按摩爾比5︰1以T4DNA連接酶進行連接。構(gòu)建好的重組表達質(zhì)粒pET28a- pro-Tg經(jīng)NdeⅠ、NcoⅠ雙酶切驗證，可得到1000 bp左右的目的條帶（見圖1A）。另對pET28apro-Tg進行pvuⅡ單酶切鑒定，因pro-Tg基因上有3個pvuⅡ酶切位點，可作特異性驗證，電泳檢測結(jié)果見圖1B。對構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pET28a- pro-Tg進行基因測序，證實其與預(yù)期結(jié)果一致，已成功將pro-Tg基因插入表達載體質(zhì)粒pET28a中。

圖1 pET28a 酶切鑒定Figure 1 Identification of pET28a by enzyme digestion

3.2 重組豬源胰蛋白酶原的誘導(dǎo)表達

pro-Tg在pET28a與BL-21(DE3)表達系統(tǒng)中，經(jīng)乳糖誘導(dǎo)表達后，14%SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示培養(yǎng)基上清液和菌體裂解液上清液幾乎無目的蛋白，而菌體裂解液沉淀中有大量蛋白，證明pro-Tg以包涵體的形式表達。每升培養(yǎng)基可獲得290 g包涵體（濕重），結(jié)果見圖2。

圖2 目的蛋白的SDS-PAGE分析檢測Figure 2 SDS-PAGE analysis and identification of target protein

3.3 激活后重組豬源胰蛋白酶的分離純化

將用標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶處理的復(fù)性液上樣至預(yù)先平衡的DEAE-FF陰離子交換柱中，再用10 mmol·L-1、80 mmol·L-1NaCl進行階段洗脫。通過活力檢測，發(fā)現(xiàn)有活性的組分位于80 mmol·L-1NaCl鹽洗脫峰中，通過14% SDS-PAGE檢測顯示目的蛋白條帶位置與標(biāo)準(zhǔn)豬源胰蛋白酶條帶位置一致（見圖3）。每升發(fā)酵液純化后得11.90 mg活性重組胰蛋白酶，回收率（即得率）為20.51%。

圖 3 重組胰蛋白酶的SDS-PAGE純化分析Figure 3 SDS-PAGE analysis of recombination trypsin purification

3.4 重組豬源胰蛋白酶的活力測定

紫外-可見光分光光度計測量△A253nm來檢測標(biāo)準(zhǔn)胰酶活化后的濃縮復(fù)性重組胰蛋白酶活性，根據(jù)公式計算得重組胰蛋白酶（總蛋白濃度1.91 g·L-1）的比活力為513.09 U·mg-1；豬胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品（1 g·L-1）所測得的比活力為2500 U·mg-1。

3.5 重組豬源胰蛋白酶切割胰島素原

實驗組與對照組酶切結(jié)果經(jīng)HPLC檢測分析報告見表1、圖4，對照標(biāo)準(zhǔn)胰島素（10 IU·mL-1，0.36 g·L-1），實驗組可得胰島素0.113 g·L-1，對照組可得胰島素0.120 g·L-1，可見重組胰蛋白酶同樣起到了很好的酶切效果。

表 1 重組胰蛋白酶切割胰島素原的HPLC分析Table 1 HPLC analysis of proinsulin digested with active recombination trypsin

圖4 胰蛋白酶實驗組、對照組激活胰島素原的HPLC分析Figure 4 Analysis of proinsulin digested with recombination trypsin by HPLC

4 討論

本實驗中重點與難點在于pro-Tg基因在大腸埃希菌中是以包涵體的形式表達，雖然包涵體蛋白沒有活性，可避免對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性以及自身的降解，但其蛋白本身含有6對二硫鍵，使得包涵體的變性、復(fù)性難度較大。在變性中，還原劑β-ME需要增大至包涵體中二硫鍵總數(shù)目的數(shù)倍以上，且在加入β-ME前向變性緩沖液中通入N2置換原溶液中所含的O2，可保證原有的二硫鍵全部斷裂，使變性過程完全。而在復(fù)性過程中，由于影響蛋白正確折疊的因素較多，如氧化還原對比例、蛋白濃度、溶液離子強度和pH值、溫度、時間等，使得重組胰蛋白酶中的6對二硫鍵錯配幾率較高，需要對復(fù)性影響因素進行綜合考慮，不斷摸索出最適復(fù)性條件來提高復(fù)性率。

在實驗操作中發(fā)現(xiàn)，若向復(fù)性液中直接加入標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶進行激活反應(yīng)，在后續(xù)酶活測定中無法檢測到酶活力，而若將復(fù)性液先進行超濾置換緩沖液，以去除原復(fù)性液中的氧化還原對及其他小分子物質(zhì)，再作激活反應(yīng)，則可檢測到酶活力，說明原復(fù)性液中的氧化還原對及其他小分子物質(zhì)對胰蛋白酶的活性可能有抑制作用。同時，該抑制作用不僅體現(xiàn)在胰蛋白酶水解肽鍵的過程中，若往酶活檢測底物BAEE溶液中加入測定量的復(fù)性緩沖液（不含重組豬源胰蛋白酶原），再加入已知有活性的標(biāo)準(zhǔn)豬源胰蛋白酶，結(jié)果檢測到的標(biāo)準(zhǔn)豬源胰蛋白酶活性值大大降低，證明該抑制作用同樣影響胰蛋白酶水解酯鍵的過程。

此外，胰蛋白酶的自溶特性對激活步驟有較大的影響，在其他相同條件下，若酶切反應(yīng)時間過長，會導(dǎo)致所得的活性胰蛋白酶量大大降低。故重組豬源胰蛋白酶原的激活反應(yīng)需要嚴(yán)格控制反應(yīng)時間，及時終止反應(yīng)避免活性胰蛋白酶的自身降解。

實驗最終純化得到重組胰蛋白酶粗品的活力為513.09 U·mL-1，為天然提取酶（標(biāo)準(zhǔn)豬源胰蛋白酶）比活力的20.52%，每升發(fā)酵液得11.90 mg活性重組胰蛋白酶，一步DEAE純化后產(chǎn)率為67.24%，得率（最終得到的有活性酶量/投入的包涵體干重）為20.51%。目前研究多為人源重組胰蛋白酶，如張文勇[12]所做人源胰蛋白酶融合表達，每升發(fā)酵液獲得1.6 mg活性蛋白；如涂艷等[13]所做人胰蛋白酶的包涵體表達，其終產(chǎn)物比活力為74 U·mL-1，采用本實驗中的方法，獲得的重組胰蛋白酶得率與比活力均較高。為了利于工業(yè)化生產(chǎn)使用，進一步提高該重組胰蛋白酶的純度、得率和比活力的研究正在進行中。

[參 考 文 獻]

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Cloning and Expression of Porcine-recombination Trypsinogen Gene and Its Activity Analysis

FENG Xueting1,2, LIU Suli2, HUANG Xiao2, WANG Yunkang1, LONG Jun3, JIN Liang1, CAO Rongyue1
( 1.School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China; 2.Js Bioway Pharmaceutical Co., LTD,Changzhou 213000, China; 3. School of Life Science and Technolog, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China)

Objective: To optimize and express the gene of recombinant porcine trypsinogen, and to detect the specifc activity after purifcation. Methods: The aynthetic porcine-recombination trypsinogen gene, of which the rare codon was substituted, was inserted into pET28a and then transformed into E.coli BL21(DE3). Porcine-recombination trypsinogen was obtained in the inducement of lactose. The target protein by using anion exchange chromatography was purifed and its activity was detected with UV spectrophotometer. Results: The inactive inclusion body of porcinerecombination trypsinogen was obtained. From the result of SDS-PAGE, its relative molecular mass met the expectation, and the specifc activity achieved 513.09 U?mg-1after purifcation. Conclusion: The porcine-recombination trypsin was successfully obtained, which had the better specifc activity. It is important to raise awareness of recombination trypsin and industrial production.

recombinant trypsin; denaturing of inclusion body; induction of lactose; dilution method

Q556+.3

B

1001-5094（2014）12-0916-06

接受日期：2014-11-10

項目資助：國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（No.J1030830)；國家自然科學(xué)基金（No.81172973；No.81373232）

*通訊作者：曹榮月，副教授，碩士生導(dǎo)師；

研究方向：微基因藥學(xué)；

Tel：025-83271242；E-mail：caorongyuenanjing@126.com