極耐熱性乳酸脫氫酶高效表達(dá)、純化及酶學(xué)性質(zhì)

錢國軍，陳彩平，翟如英，邵蔚藍(lán)，梅艷珍

1南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210046

2江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212000

在酶的6大類型中，30%–35%為氧化還原酶[1]，由于氧化還原酶在催化制備手性醇、氨基酸、羥基酸方面顯示出極大的優(yōu)勢(shì)，因此在制藥、食品、精細(xì)化工、農(nóng)藥等領(lǐng)域具有重要的用途，它的應(yīng)用也越來越受到人們的重視[2-6]。大約80%的氧化還原酶需要尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD，NADH)作為輔酶，然而NAD和NADH的價(jià)格昂貴，通常比酶促反應(yīng)所得產(chǎn)物要貴得多。因此，從技術(shù)經(jīng)濟(jì)性的角度來看，對(duì)輔酶進(jìn)行再生并循環(huán)使用很有必要[7-9]。輔酶因子再生手段主要有化學(xué)法、酶法、電化學(xué)法、光化學(xué)法和基因工程法。酶法是被研究和應(yīng)用最多的再生手段，通過偶聯(lián)的氧化還原反應(yīng)對(duì)輔酶進(jìn)行再生并循環(huán)使用是一個(gè)重要策略[10-16]。

乳酸脫氫酶 (LDH)是以NADH為輔酶，將丙酮酸經(jīng)過生化反應(yīng)生成乳酸，同時(shí)將NADH氧化成NAD[17]。由于乳酸脫氫酶和其反應(yīng)底物丙酮酸市場(chǎng)價(jià)格相對(duì)較便宜，性質(zhì)穩(wěn)定，因此很早之前Wong和Whitesides就提出用乳酸脫氫酶進(jìn)行輔酶NAD的再生[18]。作為輔酶再生的工業(yè)用酶，人們期望所用的酶具有價(jià)格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定、活性高等特點(diǎn)，極耐熱性酶在制備和應(yīng)用中易于滿足這些要求。雖然已經(jīng)在許多微生物中發(fā)現(xiàn)有乳酸脫氫酶，并且有些已經(jīng)對(duì)它的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究[19-20]，但是目前已報(bào)道的熱穩(wěn)定性乳酸脫氫酶并不多。海棲熱袍菌Thermotoga maritima是一種生長(zhǎng)在55–90℃的海底火山口附近、嚴(yán)格厭氧的細(xì)菌[21]。海棲熱袍菌產(chǎn)生的乳酸脫氫酶具有熱穩(wěn)定性好、活性高等特點(diǎn)，但是海棲熱袍菌生長(zhǎng)條件苛刻，且乳酸脫氫酶 (Tm-LDH)的產(chǎn)生量很低[22]，工業(yè)用酶需要通過基因重組表達(dá)制備。Tm-LDH基因在T7載體中未能實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，并且重組酶的酶學(xué)性質(zhì)也未曾報(bào)道過[23]。因此，研究Tm-LDH基因高效表達(dá)的基因工程技術(shù)及其重組酶酶學(xué)性質(zhì)對(duì)于極耐熱性LDH的開發(fā)利用具有重要意義。本研究采用受σ32調(diào)控的pHsh熱激表達(dá)載體[24]，對(duì)海棲熱袍菌的乳酸脫氫酶進(jìn)行高效表達(dá)，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，為輔酶再生系統(tǒng)的建立和乳酸的酶法生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

海棲熱袍桿菌Thermotoga maritima MSB8購自美國菌種保存中心，編號(hào)為ATCC43589；大腸桿菌Escherichia coli JM109購于Promega(Wisconsin，USA)；質(zhì)粒pHsh由仙奕生物科技 (南京)南京有限公司 (Shine E Biotech,Nanjing,China) 提供[24]。

1.1.2 主要試劑

限制酶T4 DNA連接酶和DNA聚合酶購自寶生物工程公司；質(zhì)粒抽提試劑盒，割膠回收試劑盒購自Qiagen公司；丙酮酸鈉，NADH均購自南京丁貝生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

E.coli培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)化子的選擇用含有氨芐青霉素 (10 μg/mL)的LB培養(yǎng)基，重組酶最高產(chǎn)量測(cè)定用含有氨芐青霉素(10 μg/mL)的TB培養(yǎng)基，配方見文獻(xiàn)[25]。電轉(zhuǎn)化用SOC培養(yǎng)基。T.maritima培養(yǎng)基的制備及T.maritima的接種與培養(yǎng)參考文獻(xiàn)[26]。

1.2.2 基因操作

T.maritima基因組DNA提取，DNA的內(nèi)切酶水解和連接，DNA片段的分離，感受態(tài)細(xì)胞的制備以及基因的高效電轉(zhuǎn)化均參考文獻(xiàn)[25]。質(zhì)粒的制備，從瓊脂糖凝膠回收DNA等操作按照Qiagen試劑盒使用指南進(jìn)行。

1.2.3 乳酸脫氫酶表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的T.maritima的乳酸脫氫酶基因序列 (TM1867,Accession No.897800)，以及pHsh中的限制性酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物 1和引物 2，引物 1： 5′-catgccatggctaaaata ggtatcgtaggactcg-3′，其中含有NcoⅠ酶切位點(diǎn)和起始密碼子；引物 2：5′-ccgctcgagttaaccgc tggtgttctgg-3′(含XhoⅠ酶切位點(diǎn))。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用此引物，以T.maritima菌的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增參數(shù)為：95℃ 5 min；98℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán)35次；72℃保溫10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，電泳檢測(cè)并將PCR目標(biāo)條帶割膠回收；用NcoⅠ和XhoⅠ酶切，濃縮，以適當(dāng)比例與NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切的載體pHsh大片段混合并連接，電轉(zhuǎn)化E.coli JM109，篩選含LDH基因片段的表達(dá)質(zhì)粒pHsh-ldh。

1.2.4 LDH基因的表達(dá)和重組酶的分離純化

基因轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)表達(dá)方法：將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli JM109，挑取單菌落接入含有氨芐青霉素 (Amp)抗性的LB培養(yǎng)液中。30℃培養(yǎng)至OD600為0.6–0.8，后轉(zhuǎn)入42℃水浴搖床，200 r/min熱激誘導(dǎo)8 h，離心，收集菌體細(xì)胞。

重組酶的純化：將離心收集的細(xì)胞用50 mmol/L的咪唑鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液 (pH 7.0)重懸，經(jīng)高壓細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，13 000×g離心15 min，取上清于80℃熱處理1 h后，13 000×g離心15 min，離心上清液過陰離子柱(離子交換層析)，經(jīng)NaCl離子梯度洗脫，完成粗酶純化，使重組酶達(dá)到電泳均一。

1.2.5 酶活性測(cè)定

乳酸脫氫酶活性測(cè)定采用分光光度法，以丙酮酸鈉和NADH為底物，測(cè)定反應(yīng)體系中NADH的下降量[22]。反應(yīng)體系為200 μL，內(nèi)含1 mmol/L的丙酮酸鈉，1 mmol/L的NADH，7.3 μg酶，50 mmol/L的咪唑鄰苯二甲酸氫鉀(pH 7.0)?？瞻讓?duì)照中不加酶，補(bǔ)加等體積的緩沖液，85℃反應(yīng)5 min后，冰浴中迅速終止反應(yīng)，用分光光度計(jì)在340 nm處測(cè)定其吸收值，計(jì)算相對(duì)于空白對(duì)照的下降值[22]。

乳酸脫氫酶酶活單位定義：每分鐘氧化NADH 1 μmol所需要的酶量定義為一個(gè)活性單位[22]。用NADH作標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白質(zhì)濃度用Brandford法測(cè)定。

1.2.6 重組酶的性質(zhì)分析

重組酶的性質(zhì)分析均使用熱處理后，并且進(jìn)一步用DEAE-Sepharose FF處理之后的純酶。

最適反應(yīng)溫度的測(cè)定：在60–100℃范圍內(nèi)，每隔5℃分別測(cè)定酶活 (pH 7.0)。以最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

最適反應(yīng)pH：在pH 4.5–8.0范圍內(nèi)每隔0.5個(gè)pH單位測(cè)定酶活，緩沖液是50 mmol/L咪唑鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液。最高活性被設(shè)定為100%，用以計(jì)算相對(duì)活性的變化。

溫度穩(wěn)定性：在酶活性相對(duì)穩(wěn)定的pH 7.0下，緩沖液為咪唑鄰苯二甲酸氫鉀，使酶在某個(gè)溫度下保溫不同的時(shí)間，再測(cè)定相對(duì)酶活，以70℃保存的酶樣活性為100%，計(jì)算百分比，確定酶的溫度穩(wěn)定性。

pH穩(wěn)定性：酶在pH 5.0–8.0條件下，緩沖液為咪唑鄰苯二甲酸氫鉀，在酶活性相對(duì)穩(wěn)定的溫度70℃下保溫1 h后，再分別測(cè)定殘留酶活性，與不保溫酶的酶活相比，計(jì)算百分比，確定酶的pH穩(wěn)定性。

酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定：以20 mmol/L的丙酮酸鈉為母液，分別以1–20 μL不等的量加入含有2 mmol/L的NADH的終體積為200 μL酶活反應(yīng)體系中，在最適反應(yīng)條件下，測(cè)定酶活力。采用Eadie-Hofstee作圖法，計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

以100 mmol/L的NADH為母液，分別以1–20 μL不等的量加入含有2 mmol/L的丙酮酸鈉的終體積為200 μL酶活反應(yīng)體系中，在最適反應(yīng)條件下，測(cè)定酶活力。采用Eadie-Hofstee作圖法，計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

金屬離子及有機(jī)抑制劑對(duì)酶活性影響的測(cè)定：以7.3 μg酶、1 mmol/L金屬離子或者有機(jī)抑制劑、1 mmol/L NADH、1 mmol/L的丙酮酸鈉和50 mmol/L咪唑鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液為200 μL反應(yīng)體系，在最適反應(yīng)條件下測(cè)定酶活力，以標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中的酶活力作為100%，計(jì)算百分比，確定金屬離子及有機(jī)試劑對(duì)酶活性的影響。測(cè)試的金屬離子分別為 Mg2+、Li+、Sr2+、Ca2+、Zn2+、Co2+、Mn2+、Ni2+和Cu2+，選取的有機(jī)抑制劑為SDS、Triton-X100和EDTA。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以T.maritima菌的基因組DNA為模板進(jìn)行乳酸脫氫酶基因片段的PCR擴(kuò)增,電泳檢測(cè)結(jié)果表明,在0.96 kb附近有一條很亮的擴(kuò)增帶，與報(bào)道的乳酸脫氫酶基因序列大小一致，沒有明顯的非特異性條帶，說明所選PCR擴(kuò)增條件能有效擴(kuò)增基因片段。將PCR產(chǎn)物克隆至熱激載體pHsh中，構(gòu)建出重組質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，重組質(zhì)粒能被NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切得到兩條分別為0.96 kb和2.3 kb的條帶 (圖1)。因此，初步證明目標(biāo)基因已插入熱激載體中。

2.2 乳酸脫氫酶基因在E.coli中的表達(dá)及純化

用重組質(zhì)粒pHsh-ldh和質(zhì)粒pHsh分別轉(zhuǎn)化E.coli JM109，30℃培養(yǎng)，后轉(zhuǎn)入42℃熱激誘導(dǎo)8 h，收集菌體細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE(分離膠的濃度為12%)，考馬斯亮藍(lán)染色的結(jié)果見圖2。從電泳圖譜上可以看出，含有重組質(zhì)粒的E.coli在分子量33 kDa處有明顯的蛋白表達(dá)帶，酶活達(dá)到28 112 U/mL，由此可知乳酸脫氫酶基因通過熱激質(zhì)粒pHsh在E.coli中實(shí)現(xiàn)了超量表達(dá)。

圖1 重組質(zhì)粒pHsh-ldh酶切及PCR擴(kuò)增片段鑒定Fig.1 PCR amplification of ldh and restriction analysis of recombinant plasmid.M:DNA marker;1:PCR amplification of gene;2:fragments of 2.4 kb and 0.96 kb produced after a double-enzyme digestion of pHsh-ldh;3:a 3.4 kb fragment produced after a single enzyme digestion of pHsh-ldh.

將熱激誘導(dǎo)的菌體細(xì)胞通過高壓破碎裂解，80℃熱處理1 h，取上清液SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果表明重組酶經(jīng)熱處理后，酶純度大幅度提高，基本除去大部分的雜蛋白，純化結(jié)果見表1。由表1可知，經(jīng)過熱處理后，重組酶的蛋白量為34.1 mg/mL，比酶活也提高到2 674 U/mg，酶活達(dá)到91 183 U/mL。

2.3 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)

酶學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果表明該酶的最適反應(yīng)溫度為95℃，90℃半衰期為2 h，95℃保溫2 h后能保持約30%的活力。有趣的是該酶適應(yīng)較寬廣的反應(yīng)溫度，在65℃的反應(yīng)條件下，該酶的活性達(dá)到50%(圖3)，然而在這種常規(guī)溫度下酶的活性能夠長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定 (圖4)。

該酶的最適pH為7.0，從5.0–7.0酶活快速升高 (圖5)，但是在pH 5.5–8.0之間酶的活力穩(wěn)定在60%以上 (圖6)。

圖2 乳酸脫氫酶純化過程的SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE analysis of Tm-LDH in purification steps.M:protein marker;1:cell-free extract of E.coli JM109/pHsh;2:cell-free extract of E.coli JM109/pHsh-ldh;3:proteins remained after a heat treatment of 1 h;4:the purified recombinant LDH protein.

表1 E.coli中重組乳酸脫氫酶的純化Table 1 Purification of the recombinant lactate dehydrogenase from E.coli

圖3 Tm-LDH的最適反應(yīng)溫度Fig.3 Optimum temperature for lactate dehydrogenase activity.

圖4 Tm-LDH的溫度穩(wěn)定性Fig.4 Thermal stability of lactate dehydrogenase.The purified enzyme was pre-incubated for various time at 65 ℃ (◆),85 ℃ (■),90 ℃ (▲)and 95 ℃ (×).

圖5 Tm-LDH的最適反應(yīng)pHFig.5 Optimum pH for lactate dehydrogenase activity.

由表 2可知 Mg2+、Li+、Sr2+、Ca2+、Cu2+對(duì)酶的活性沒有顯著影響；SDS、Zn2+對(duì)酶活均有顯著的抑制作用。Co2+、Mn2+、Ni2+、Triton-X100和EDTA對(duì)酶活有顯著的促進(jìn)作用。以丙酮酸鈉和NADH為底物時(shí)，在85℃、pH 7.0條件下，其丙酮酸鈉的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km值為 1.7 mmol/L，Vmax值為 3.8×104U/mg；其NADH的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km值為7.2 mmol/L，Vmax為 1.1×105U/mg。

表2 金屬離子及抑制劑對(duì)Lactate Dehydrogenase活性的影響Table 2 Effect of metal ions and inhibitors on the activity of Lactate Dehydrogenase

3 討論

海棲熱袍菌T.maritima是一個(gè)嗜極端高溫的厭氧真細(xì)菌，生長(zhǎng)在55℃–90℃海底火山口處，是極端耐熱性酶的重要來源。但是海棲熱袍菌生長(zhǎng)條件苛刻，細(xì)胞密度較低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。基因重組技術(shù)是獲得重組酶高效生產(chǎn)的有效途徑，但是絕大多數(shù)來源于極端高溫菌的自然基因在E.coli中的表達(dá)水平很低。因此，構(gòu)建合適的極端菌的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，高效率地表達(dá)一些極端酶，一直是人們研究的熱點(diǎn)。本研究利用pHsh表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)了Tm-LDH的一步超量表達(dá)，克服了傳統(tǒng)的海棲熱袍菌中乳酸脫氫酶基因工程菌構(gòu)建困難、乳酸脫氫酶表達(dá)量較低等難題。實(shí)現(xiàn)超量表達(dá)不僅便于獲得大量純酶從而進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用技術(shù)的研究，而且為該酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。pHsh表達(dá)載體的另一個(gè)特點(diǎn)是可以有效地進(jìn)行熱激誘導(dǎo)表達(dá)，不需要加入IPTG等比較昂貴的化學(xué)誘導(dǎo)劑。

酶學(xué)性質(zhì)研究表明Tm-LDH具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，90℃酶活半衰期2 h。有趣的是該酶雖然最適反應(yīng)條件為95℃、pH 7.0，但是它在較寬廣的溫度和pH范圍內(nèi)活性都很高。該酶在低至65℃的反應(yīng)條件下活性達(dá)到最高活性的50%(相當(dāng)于 1 600 U/mg蛋白)，然而在這種常規(guī)溫度下酶的活性能夠長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定。脫氫酶的這種性質(zhì)對(duì)于酶的應(yīng)用前景尤為重要。在涉及輔酶的氧化還原反應(yīng)的生物化工過程中，生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益和可持續(xù)性都要求氧化型或還原型的輔酶能夠得到再生。例如，如果氧化性輔酶NAD依賴性的2,3-丁二醇脫氫酶與NADH依賴性乳酸脫氫酶聯(lián)用，就可以建立輔酶再生體系，實(shí)現(xiàn)手性乙偶姻和乳酸的持續(xù)生產(chǎn)。因此，Tm-LDH適應(yīng)較寬廣的溫度和pH范圍，有利于它在反應(yīng)條件方面與不同來源的NAD依賴性脫氫酶的配伍，構(gòu)建成高效、穩(wěn)定性的輔酶循環(huán)體系。

研究表明，利用海棲熱袍菌乳酸脫氫酶的極耐熱性，將重組菌細(xì)胞破碎后的上清經(jīng)過80℃的熱處理后，無需經(jīng)過任何色譜層析系統(tǒng)就可獲得較高純度的重組酶，這大大地簡(jiǎn)化了重組酶的純化步驟，同時(shí)也極大地降低了該酶的下游處理成本，為重組酶的大規(guī)模工業(yè)化提取奠定了基礎(chǔ)。并且發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過熱處理之后的重組酶總酶活大幅度提高，這種實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象重復(fù)性極高，我們推測(cè)可能的原因是由于經(jīng)過熱處理后，某些對(duì)酶活有副作用的因子被去除了；或者是由于該酶來源于嗜熱菌而重組表達(dá)是在常溫下，熱處理可以通過改變?cè)撁傅臉?gòu)象而更好地激活該酶。類似Tm-LDH熱處理之后總酶活大幅度提高的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，在其他極耐熱性重組酶性質(zhì)分析中也有相關(guān)報(bào)道，但均未給出合理解釋。對(duì)這些現(xiàn)象的研究將有助于我們更進(jìn)一步了解耐熱酶的分子機(jī)制，將有利于微生物極端酶的開發(fā)和利用，更進(jìn)一步的研究還在進(jìn)行中。

本研究著重對(duì)該重組酶進(jìn)行了高效表達(dá)，并且對(duì)該重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析和測(cè)定，并對(duì)該酶在NAD再生的工業(yè)化應(yīng)用前景進(jìn)行了探討和展望；但對(duì)該酶在NAD再生體系中具體應(yīng)用還處于探索階段。我們相信，對(duì)該酶在NAD再生體系中的更進(jìn)一步研究，將有利于NAD再生體系的完善及在工業(yè)化條件下的推廣與應(yīng)用。

[1]Lü CQ,Jiang ZY,Wang J.Progress in regeneration of NAD(P)and NAD(P)H.Chin J Organic Chem,2004,24(11):1366?1379(in Chinese).呂陳秋,姜忠義,王姣.煙酰型輔酶 NAD(P)和NAD(P)H再生的研究進(jìn)展.有機(jī)化學(xué),2004,24(11):1366?1379.

[2]Hummel W.Large-scale application of NAD(P)-dependent oxidoreductases:recent developments.Trends Biotechnol,1999(4):487?491.

[3]Straathof A,Panke S,Schmid A.The production of fine chemicals by biotransformations.Curr Opin Biotechnol,2002,13(6):548?556.

[4]DeSantis G,Davis B.The expanding roles of biocatalysis and biotransformation.CurrOpin Chem Biol,2006,10(2):139?140.

[5]Huang Y,Liu N,Wu X,et al.Dehydrogenases/Reductases for the synthesis of chiral pharmaceuticalintermediates.CurrOrg Chem,2010,14(14):1447?1460.

[6]Chen Y,Chen C,Wu X.Dicarbonyl reduction by single enzyme for the preparation of chiral diols.Chem Soc Rev,2012,41(5):1742?1753.

[7]Kim Y,Yoo Y.Regeneration of the nicotinamide cofactorusing a mediator-free electrochemical method with a tin oxide electrode.Enzyme Microb Technol,2009,44(3):129?134.

[8]Wagenknecht P, Penney J, Hembre R.Transition-metal-catalyzed regeneration of nicotinamide coenzymes with hydrogen.Organometallics,2003,22(6):1180?1182.

[9]Berríos-Rivera S,Bennett G,San K.Metabolic engineering of Escherichia coli:increase of NADH availability by overexpressing an NAD dependent formate dehydrogenase.Metab Eng,2002,4(3):217?229.

[10]Chenault H,Simon E,Whitesides G.Cofactor regeneration for enzyme-catalysed synthesis.Biotechnol Genet Eng Rev,1988(4):221?270.

[11]JohannesT,WoodyerR,Zhao H.Directed evolution of a thermostable phosphite dehydrogenase for NAD(P)H regeneration.Appl Environ Microb,2005,71(10):5728?5734.

[12]Wong C,Whitesides G.Enzyme-catalyzed organic synthesis:NAD(P)H cofactor regeneration by using glucose 6-phosphate and the glucose-6-phosphate dehydrogenase from Lenconostoc mesenteroides.J Am Chem Soc,1981(103):4890?4899.

[13]Du W,Yu Z.Biomimetic in situ regeneration of cofactors NAD(P)+and NAD(P)H models hantzsch esters and dihydrophenanthridine. Synlett,2012(23):1300?1304.

[14]Wichmann R, Vasic-Racki D. Cofactor regeneration at the lab scale.Adv Bio Chem Eng Biotechnol,2005(92):225?260.

[15]Schroer K,Luef K,Hartner F,et al.Engineering the Pichia pastoris methanol oxidation pathway for improved NADH regeneration during whole-cell biotransformation.Metab Eng,2010,12(1):8?17.

[16]Lo H,Fish R.Biomimetic NAD models for tandem cofactor regeneration, horse liver alcohol dehydrogenase recognition of 1,4-NADH derivatives,and chiral synthesis.Angew Chem Int Ed,2002,41(3):478?481.

[17]VanderJagt D,Hunsaker L,Heidrich J.Partial purif i cation and characterization of lactate dehydrogenase from Plasmodium falciparum.Mol Biochem Parasitol,1981(4):255–264.

[18]Wong C,Whitesides G.Enzymes in Synthetic Organic Chemistry.New York:Academic Press,1994.

[19]Xue GX.Progress in lactate dehydrogenase isozyme.Progr Biotechnol,1992(12):29?32(in Chinese).薛國雄.乳酸脫氫酶(LDH)同工酶研究進(jìn)展.生物工程進(jìn)展,1992(12):29?32.

[20]Kim M,WhitesG.L-Lactatedehydrogenase:substrate specificity and use as a catalyst in the synthesis of homochiral 2-hydroxy acids.J Am Chem Soc,1998(110):2959?5964.

[21]HuberR,Langworthy T,Konig H,etal.Thermotoga maritima sp.nov.represents a new genus of unique extremely thermophilic eubacteria growing up to 90℃.Arch Microbiol,1986,144(4):324?333.

[22]Wrba A,Jaenicke R,Huber R,et al.Lactate dehydrogenase from the extreme thermophile Thermotoga maritima.Eur J Biochem,1990(201):188?195.

[23]Ostendorp R,Liebl W,Schurig H,et al.The L-lactate dehydrogenase gene of the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima cloned by complementation in Escherichia coli.Eur J Biochem,1993(206):709?715.

[24]Shao W,Wu H,Pei J.Novel expression vector system regulated by sigma32 and methods for using itto producerecombinantprotein:US 2007/0254335A1.2007-11-07.

[25]Sambrook J,Frisch F,Maniatis T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd Ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.

[26]Wang Z,Pei JJ,Shao WL,et al.Expression,characterization and application of thermostable β-glucuronidase from Thermotoga maritima.Chin J Biotech,2008,24(8):1407?1412(in Chinese).王卓,裴建軍,邵蔚藍(lán),等.極耐熱性β-葡萄糖醛酸酶的高效表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)及其應(yīng)用.生物工程學(xué)報(bào),2008,24(8):1407?1412.