利用全基因組改組技術(shù)提高SubtilosinA的產(chǎn)量

袁 芳，符雨欣，黃 瑤，鐘 梁，陸兆新，呂鳳霞，趙海珍，別小妹

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇南京 210095）

利用全基因組改組技術(shù)提高SubtilosinA的產(chǎn)量

袁 芳，符雨欣，黃 瑤，鐘 梁，陸兆新，呂鳳霞，趙海珍，別小妹*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇南京 210095）

以Bacillus subtilis nja A1B2-2為出發(fā)菌株，在最佳的原生質(zhì)體形成、再生和融合條件的基礎(chǔ)上，將前期經(jīng)過(guò)理化誘變篩選的四株高產(chǎn)菌株進(jìn)行兩輪基因組改組。結(jié)果表明，當(dāng)以0.6mol/L NaCl為高滲洗滌液，0.1mg/mL溶菌酶酶解40min后，涂布在以SMM為高滲體系的NB再生培養(yǎng)基上，原生質(zhì)體形成率達(dá)到95.49%，再生率為89.25%。優(yōu)化原生質(zhì)體的融合條件，融合率達(dá)到了1.39×10-3。在此基礎(chǔ)上將四株高產(chǎn)SubtilosinA菌株進(jìn)行兩輪全基因組改組，結(jié)合雙親滅活的篩選方法，挑選出一株遺傳性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株R2-264，產(chǎn)量達(dá)17.59mg/L，比出發(fā)菌株提高了3.58倍。

原生質(zhì)體，基因組改組，穩(wěn)定性

基因組改組技術(shù)是微生物遺傳育種中的一項(xiàng)重要技術(shù)，該技術(shù)比基因工程法操作簡(jiǎn)單，克服了傳統(tǒng)育種法中種間、屬間甚至遠(yuǎn)源親本間實(shí)現(xiàn)雜交的障礙，能使遺傳基因高頻重組，并且雙親的優(yōu)良性狀集中的機(jī)會(huì)增大[1]。Hopwood等[2]提出，通過(guò)原生質(zhì)體融合的過(guò)程可以實(shí)現(xiàn)隱性基因的重組暴露，使一些隱性基因表達(dá)或隨機(jī)產(chǎn)生新的基因表型，成為育種的新途徑。

SubtilosinA是1985年Babasaki等從枯草芽孢桿菌中提取出來(lái)的[3]，SubtilosinA能抑制多種G+細(xì)菌和一些G-細(xì)菌生長(zhǎng)，對(duì)一些芽孢菌也有較好的抑制作用，如炭疽芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽孢桿菌[4]。此外還能抑制單核增生李斯特菌、藤黃微球菌、無(wú)乳鏈球菌、加德納氏菌[4]等常見(jiàn)食品中的污染菌和一些病原菌以及能夠殺滅皰疹病毒。SubtilosinA具有較好的穩(wěn)定性，在100℃條件下1h以及pH2~10的范圍內(nèi)處理無(wú)任何活性損失[5]。

本實(shí)驗(yàn)室保藏了一株產(chǎn)SubtilosinA的枯草芽孢桿菌，但其產(chǎn)量較低。本研究在原生質(zhì)體最佳形成、再生和融合的基礎(chǔ)上，通過(guò)兩輪基因組改組過(guò)程以期篩選出一株高產(chǎn)SubtilosinA且穩(wěn)定遺傳的菌株，為后續(xù)SubtilosinA的進(jìn)一步的研究打好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Bacillus subtilis nja A1B2-2，nja 4-43，nja N2-99，nja Z1-53，nja H1-65 由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院酶工程實(shí)驗(yàn)室保藏；指示菌 短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）CMCC 63202；NB 牛 肉 浸 膏 3g，魚 粉蛋 白胨10g，NaCl 5g，瓊脂1.8~2.0g，水 1000mL；LB 酵母浸膏5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，水1000mL；高滲液種類 高滲液A（SMM）：蔗糖171.5g/L，MgCl24.273g/L，順丁烯二酸2.336g/L，雙蒸水配制，pH6.5，115℃ 滅 菌30min；高 滲 液 B（高 鹽）：含0.6mol/L NaCl的0.05mol/L pH7.0的磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液；改良的HM溶液（%）：NH4Cl 0.1，Tris 1.2，KCl 0.0035，NaCl 0.0058，Na2SO40.0132，MgCl2·5H2O 0.426，葡 萄糖0.2，蔗糖170.117，pH7.5，115℃，30min滅菌[6]；甘露醇培養(yǎng)基 0.5mol/L甘露醇，115℃，30min滅菌；再生培養(yǎng)基 上層：用不同高滲液配制的NB培養(yǎng)基，瓊脂1.8%~2.0%，下層：0.8%的瓊脂，其余同上；電擊緩沖液 0.5mol/L甘露醇，0.5mol/L山梨醇，10%甘油[7]；溶菌酶液 用高滲溶液SMM配制溶菌酶液，濃度為50mg/mL，再用孔徑為0.22μm的無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌，分裝成單次使用的小份，-20℃保存。

超凈臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司；OHAUS 2100 pH計(jì) 美國(guó)OHAUS公司；高壓蒸氣滅菌鍋 日本TOMY公司；Agilent 1100 series高效液相色譜系統(tǒng) 美國(guó)Agilent公司；HYL-A全溫?fù)u瓶柜 太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；飛鴿牌系列離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；全系列伯樂(lè)Bio-rad電穿孔儀 美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞懸浮液的制備 將出發(fā)菌株在NB斜面上37℃培養(yǎng)24h，取一環(huán)于LB培養(yǎng)基中，37℃ 180r/min培養(yǎng)19h后轉(zhuǎn)接10%于另一瓶100mL新鮮LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)14h至對(duì)數(shù)末期。

1.2.2 原生質(zhì)體的制備與再生 取上述菌液5mL于離心管中，5000r/min離心20min收集菌體，將收集到的菌體用高滲液洗滌兩次，并懸浮于等體積高滲體系中。取一定量的菌體稀釋到10-4、10-5、10-6后涂布于再生培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)，得到菌落總數(shù)A。另取5mL菌懸液加入不同濃度的溶菌酶35℃水浴鍋中酶解一定時(shí)間后迅速加入10倍體積高滲液稀釋終止酶解反應(yīng)，3000r/min離心17min去酶。取沉淀用生理鹽水洗滌兩次并重懸于等體積的生理鹽水中，稀釋合適倍數(shù)涂布雙層再生平板得到未酶解的菌落總數(shù)B；另取沉淀用高滲溶液洗滌兩次并重懸于等體積高滲液中，稀釋合適的倍數(shù)后涂布雙層再生平板得到再生平板上總的菌落數(shù)C。原生質(zhì)體形成率和再生率的計(jì)算式為：

原生質(zhì)體形成率（%）=（A-B）/A×100

原生質(zhì)體再生率（%）=（C-B）/（A-B）×100

其中：A-酶解前菌落總數(shù)；B-未被酶解的菌落數(shù)；C-再生培養(yǎng)基平板上的菌落總數(shù)。

1.2.3 原生質(zhì)體滅活 取前期制備的原生質(zhì)2mL于6cm小平板中，加入大頭針，放置在超凈臺(tái)中的磁力攪拌器上，18W紫外燈下15cm照射一定時(shí)間后暗光操作，取100μL涂布雙層再生平板。另取2mL原生質(zhì)體懸液于滅菌的離心管中，100℃沸水浴中滅活一定時(shí)間后取100μL涂布雙層再生平板，同時(shí)取未經(jīng)任何處理的原生質(zhì)體100μL涂布再生平板作對(duì)照，37℃培養(yǎng)36~48h后菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算再生平板上未被滅活的菌落數(shù)。

1.2.4 原生質(zhì)融合 在研究了相關(guān)文獻(xiàn)[8-10]的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)利用電穿孔儀對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行電融合操作。先取紫外滅活、熱滅活兩種不同方式滅活的原生質(zhì)體各取1mL混勻，放置5min后3000r/min離心17min，用電極緩沖液洗滌2~3次后溶解在等體積的電極緩沖液中，取出100μL于電極杯中，先設(shè)定細(xì)胞排列成串條件：脈沖電壓150V，脈沖寬電極緩沖液中，取100μL滅活的原生質(zhì)體于2mm的電極杯中，設(shè)置原生質(zhì)體排列條件為脈沖寬度100ms、脈沖個(gè)數(shù)9以及合適的脈沖電壓和脈沖間隔，使原生質(zhì)體排列成串。室溫放置1min，進(jìn)行原生質(zhì)體電穿孔，電穿孔條件為脈沖間隔為5s、脈沖個(gè)數(shù)為2以及適合的脈沖電壓和脈沖寬度。以上最優(yōu)條件的選擇均以原生質(zhì)體融合率的高低進(jìn)行比較。反應(yīng)結(jié)束后，室溫下放置15min，涂布雙層再生平板并置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)36~48h。原生質(zhì)體融合率計(jì)算公式如下：

其中：D-紫外滅活后再生平板上的菌落數(shù)；E-熱滅活后再生平板上的菌落數(shù)；F-融合后再生平板上的總菌落數(shù)。

1.2.5 融合子的篩選 用滅菌的牙簽從再生平板上挑選360株融合子點(diǎn)在LB固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)24h后，用打孔器將菌圈周圍的瓊脂塊打下，置于短小芽孢桿菌的指示菌平板上培養(yǎng)16~18h，挑選出抑菌圈較大的50株菌在LB中發(fā)酵24h，5000r/min將菌體離心，上清用HCl調(diào)pH至2.0，4℃放置隔夜，5000r/min離心去除上清，沉淀用甲醇浸提2~5h，過(guò)0.22μm濾膜后HPLC檢測(cè)含量。

短小芽孢桿菌指示菌平板的制作：用接種環(huán)取短小芽孢桿菌于新鮮的NB斜面上，37℃活化24h。取5mL生理鹽水于試管內(nèi)，螺旋儀上振蕩，將菌體洗下，調(diào)整菌濃度OD600=0.5，制成菌懸液。取滅過(guò)菌的雙面板2塊，倒入10mL 3%的瓊脂作為底層。將上述菌懸液倒入55℃左右融化的NB培養(yǎng)基中，搖勻后取25mL加入上述瓊脂底層，室溫凝固后即為抑菌平板。

1.2.6 兩輪基因組改組 將出發(fā)菌株nja A1B2-2，nja 4-43，nja N2-99，nja Z1-53，nja H1-65進(jìn)行第一輪融合，并進(jìn)行高產(chǎn)菌株的篩選，將第一輪篩選到的4株高產(chǎn)菌株進(jìn)行第二輪融合。

1.2.7 高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將篩到的高產(chǎn)菌株在NB平板上傳代8代后，將1、2、4、6、8代分別接種在LB中發(fā)酵24h，發(fā)酵液處理過(guò)程同1.2.5，將甲醇浸提物過(guò)0.22μm濾膜后HPLC檢測(cè)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體的制備與再生

2.1.1 洗滌高滲系統(tǒng)的篩選 原生質(zhì)體酶解前后采用甘露醇、SMM和高鹽三種高滲液洗滌菌體和原生質(zhì)體，對(duì)比原生質(zhì)體形成率和再生率的效果如圖1所示。

由圖1中可看出，三種洗滌高滲體系使原生質(zhì)體的形成率均在90%以上，但以SMM為洗滌高滲體系時(shí)，再生率只有0.06%，以HM作為洗滌高滲液時(shí)的再生率為4.06%，而將高鹽作為洗滌高滲液時(shí)，再生率達(dá)到34.1%。以鹽溶液作為高滲洗滌體系的再生率要較糖和糖醇系統(tǒng)好，可能是脫壁后的原生質(zhì)體在鹽溶液系統(tǒng)中更容易保持形態(tài)的穩(wěn)定，從而在再生培養(yǎng)基中更容易再生。

2.1.2 再生培養(yǎng)基高滲體系的篩選 將酶解后的原生質(zhì)體涂布在以NB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分的培養(yǎng)基中，其中溶液體系分別換成甘露醇、SMM和高鹽，考察再生培養(yǎng)基中高滲液體系對(duì)原生質(zhì)體再生效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖1 洗滌高滲液對(duì)原生質(zhì)體形成和再生的影響Fig.1 Effect of the hypertonic solution for washing on protoplast formation and regeneration

圖2 再生培養(yǎng)基高滲體系對(duì)原生質(zhì)體再生的影響Fig.2 Effect of hyperosmotic solution in regeneration medium on protoplast regeneration

再生培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)原生質(zhì)體的再生具有較為顯著的影響，適量的二價(jià)離子如Ca2+和Mg2+也能提高再生率。高滲液的種類也會(huì)影響原生質(zhì)體的再生，對(duì)易于滲入質(zhì)膜或被原生質(zhì)體分解的物質(zhì)不宜作為穩(wěn)定劑。

通過(guò)改變?cè)偕囵B(yǎng)基中高滲體系的種類以提高原生質(zhì)體的再生率。由圖2中可看出，當(dāng)以洗滌高滲液高鹽體系作為再生培養(yǎng)基的高滲體系時(shí)，再生率只有0.11%，以甘露醇為再生培養(yǎng)基的高滲體系時(shí)再生率則達(dá)到65.2%，但由于甘露醇成本較高，故本實(shí)驗(yàn)選擇價(jià)格較廉的SMM作為再生培養(yǎng)基的高滲體系，其再生率為34.09%，可能是由于糖和糖醇體系對(duì)原生質(zhì)體的保護(hù)作用，使得細(xì)胞壁更易于再生出來(lái)[11]。

2.1.3 溶菌酶濃度對(duì)原生質(zhì)體形成率與再生率的影響 選擇不同的溶菌酶濃度0.1、0.2、0.3、0.4mg/mL分別酶解30min后涂布再生平板，原生質(zhì)體的形成率和再生率見(jiàn)圖3。

圖3 溶菌酶濃度對(duì)原生質(zhì)體形成和再生的影響Fig.3 Effect of lysozyme concentration on protoplast formation and regeneration

由圖3可看出，Bacillus subtilis nja A1B2-2對(duì)溶菌酶較為敏感，隨著溶菌酶溶度的增加，原生質(zhì)體形成率均在90%以上，但再生率隨著酶解時(shí)間的增加而逐漸降低，可能是高的溶菌酶濃度使原生質(zhì)體脫水皺縮[12]影響了原生質(zhì)體的再生。此外，破碎的細(xì)胞壁可作為原生質(zhì)體再生的引物，酶解濃度過(guò)高使得細(xì) 胞 壁 脫 除 得 太 徹 底 ，也 不 利 于 再 生[13]。 故 選 擇0.1mg/mL作為酶解濃度，再生率為32.5%。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成率與再生率的影響

用0.1mg/mL溶菌酶分別酶解不同時(shí)間，考察酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成率與再生率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成和再生的影響Fig.4 Effect of different enzymatic time on protoplast formation and regeneration

由圖4可看出，當(dāng)酶解40min時(shí)，原生質(zhì)體再生率已達(dá)到89.25%，繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間后，再生率呈下降趨勢(shì)，可能是較長(zhǎng)的酶解作用使得細(xì)胞質(zhì)體膜穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致原生質(zhì)體破碎或活力的下降[14]，故選擇40min為最佳酶解時(shí)間，此時(shí)原生質(zhì)體形成率達(dá)到95.49%，再生率為89.25%。

2.2 原生質(zhì)體的滅活條件

通過(guò)紫外滅活和熱滅活的方式對(duì)融合子進(jìn)行篩選，滅活結(jié)果如圖5和圖6所示。

紫外滅活原生質(zhì)體與細(xì)胞內(nèi)核酸的光化學(xué)變化有關(guān)，主要利用DNA中堿基形成的嘧啶二聚體以及DNA 的 解 螺 旋 作 用[15]；熱 滅 活 主 要 使 核 糖 體 或 核 糖體RNA受到損傷，細(xì)胞內(nèi)酶蛋白、功能蛋白的合成受到影響從而使細(xì)胞死亡[16]。

由圖5和圖6可看出，隨著紫外滅活時(shí)間的延長(zhǎng)，再生平板上再生長(zhǎng)出的細(xì)菌數(shù)逐漸減少，當(dāng)達(dá)到25min時(shí)，再生平板上已無(wú)菌體長(zhǎng)出，故選擇25min作為紫外滅活的時(shí)間；熱滅活19min以后再生平板上已無(wú)菌長(zhǎng)出，滅活時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)會(huì)影響原生質(zhì)體的再生效果，故選擇19min作為熱滅活時(shí)間。

表1 原生質(zhì)體電穿孔條件Table 1 The best condition for protoplast electroporation

表2 原生質(zhì)體排列成串條件Table 2 The best condition for protoplast arranged in clusters

圖5 紫外滅活時(shí)間對(duì)原生質(zhì)再生的影響Fig.5 The effect of UV inactivated time on protoplast regeneration

圖6 熱滅活時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體再生的影響Fig.6 The effect of heated-treat time on protoplast regeneration

2.3 原生質(zhì)體電融合

2.3.1 原生質(zhì)體電穿孔條件 設(shè)定細(xì)胞排列條件后，探索細(xì)胞穿孔的最佳條件，結(jié)果如表1所示。

由表1可看出，隨著脈沖電壓強(qiáng)度的增加，超過(guò)600V時(shí)，成串的細(xì)胞開(kāi)始發(fā)生融合現(xiàn)象，但當(dāng)電壓超過(guò)1200V時(shí)，原生質(zhì)體的融合率開(kāi)始降低，可能是在較高的脈沖電壓作用下，細(xì)胞發(fā)生裂解死亡[17-18]。脈沖寬度對(duì)融合率影響較為明顯，當(dāng)脈沖寬度較小，不足以使細(xì)胞膜穿孔發(fā)生融合，而脈沖寬度過(guò)大，細(xì)胞會(huì)發(fā)生不可逆穿孔，從而發(fā)生胞溶現(xiàn)象[19]。本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)脈沖寬度為0.5ms時(shí)融合率最高，達(dá)2.5×10-4。

2.3.2 原生質(zhì)體排列條件優(yōu)化 原生質(zhì)體排列主要受脈沖電壓和脈沖間隔兩個(gè)參數(shù)影響，因此本研究對(duì)脈沖電壓和脈沖間隔進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表2。

電融合過(guò)程首先是利用高頻交變電場(chǎng)使原生質(zhì)體排列成串，本實(shí)驗(yàn)采用方波脈沖中較低的脈沖電壓將原生質(zhì)體排列成串。從表2可看出，脈沖電壓在150V以上時(shí)，改變電壓的條件會(huì)使得融合率降低，故選擇150V脈沖電壓，排列后的原生質(zhì)融合率達(dá)到7.3×10-4。脈沖間隔偏低時(shí)，細(xì)胞成串效果不好，融合率較低，在1s時(shí)融合率最高，達(dá)到1.39×10-3，當(dāng)超過(guò)1s時(shí)，融合率又開(kāi)始下降，可能是對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了一定的損傷作用。

電融合法操作簡(jiǎn)單，融合效率高。但必須有專門的電融合儀來(lái)完成實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)電穿孔儀實(shí)現(xiàn)了原生質(zhì)體的融合過(guò)程。

2.4 兩輪基因組改組

將四株出發(fā)菌株的原生質(zhì)體進(jìn)行第一輪基因組改組，篩選到了四株較高產(chǎn)SubtilosinA的菌株，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 第一輪基因組改組篩選高產(chǎn)SubtilosinA菌株Table 3 Selection for high-yield SubtilosinA strain from the first round of gene shuffling

第一輪基因組改組篩選到4株SubtilosinA產(chǎn)量較高的融合子，其中R1-68產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了3.5倍，在此基礎(chǔ)上將第一輪篩選到的四株高產(chǎn)菌進(jìn)行第二輪基因組改組，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 第二輪基因組改組篩選高產(chǎn) SubtilosinA菌株Table 4 Selection for high-yield subtilosinA strain from the second round of gene shuffling

由表3和表4看出，第二輪改組產(chǎn)量增加的幅度已很低，只有一株菌R2-264的產(chǎn)量較第一輪篩選的R1-68的產(chǎn)量高6%，因此，本實(shí)驗(yàn)只進(jìn)行了兩輪基因組改組過(guò)程，其中第二輪中篩選到的融合子R2-264產(chǎn)量最高，達(dá)17.59mg/L。

2.5 高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將篩到的高產(chǎn)菌株R2-264進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，第1、2、4、6、8代SubtilosinA的產(chǎn)量如表5所示。由表5可看出融合子R2-264產(chǎn)SubtilosinA的遺傳性狀穩(wěn)定。這也驗(yàn)證了全基因組改組技術(shù)所獲的改組菌株能較好地保持了親本的穩(wěn)定性的特點(diǎn)。

表5 SubtilosinA高產(chǎn)菌株R2-264的遺傳穩(wěn)定性Table 5 The stability of high-yield SubtilosinA strain R2-264

3 結(jié)論

基因組改組技術(shù)因不受親本菌株親緣關(guān)系的限制，且可以較大幅度地將提高親本基因間的重組頻率從而能夠集中優(yōu)良基因等優(yōu)點(diǎn)已成為目前工業(yè)微生物改良的重要方法之一。本實(shí)驗(yàn)將前期經(jīng)過(guò)理化誘變得到的四株高產(chǎn)SubtilosinA菌株進(jìn)行了兩輪基因組改組，并篩選到一株比出發(fā)菌株R2-264產(chǎn)量提高3.58倍的融合子，其SubtilosinA產(chǎn)量達(dá)到17.59mg/L，且遺傳穩(wěn)定性良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步展現(xiàn)了全基因組改組技術(shù)在提高工業(yè)微生物發(fā)酵過(guò)程中次級(jí)代謝產(chǎn)物提高方面的顯著作用。

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The breeding for high-yield subtilosina strain with genome shuffling

YUAN Fang，F(xiàn)U Yu-xin，HUANG Yao，ZHONG Liang，LU Zhao-xin，LV Feng-xia，ZHAO Hai-zhen，BIE Xiao-mei*
（College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

Bacillus subtilis nja A1B2-2 as the starting strain ， based on the optimum conditions for protoplast formation，regeneration and protoplasts fusion，genome shuffling was carried out between four mutant strains screened from phys-chem mutagenesis.The results showed when the hypertonic washing solution 0.6mol/L NaCl，0.1mg/mL lysozyme treating for 40min，spreading on gregeneration medium NB with hypertonic SMM，protoplast formation rate and the regeneration rate respectively reached 95.49%and 89.25%.After optimizing protoplast fusion conditions，its rate was up to 1.39 ×10-3.Then two round of genome shuffling was launched between four high-yield SubtilosinA strains.With the selection system of double inactivation of parental protoplasts，a stable and high-yield strain R2-264 was selected out with the maximum production of SubtilosinA at 17.59mg/L，which was 3.58 times higher than the starting strain.

protoplast；genome arrangement；stability

TS201.1

A

1002-0306（2014）22-0167-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.028

2014－03－03

袁芳（1988-），女，在讀碩士研究生，研究方向：微生物代謝與發(fā)酵工程。

* 通訊作者：別小妹（1964-），女，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向：食品生物技術(shù)和食品微生物。