• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    腸道細(xì)菌對(duì)阿魏酸的代謝研究

    2014-03-04 21:39:15張蔚江曙等
    分析化學(xué) 2014年2期
    關(guān)鍵詞:超純水菌液質(zhì)譜

    張蔚 江曙等

    摘 要 研究人體腸道細(xì)菌對(duì)阿魏酸的代謝。采集健康志愿者新鮮糞便,稱重稀釋后厭氧培養(yǎng),通過反復(fù)涂布分離得到69種人體腸道細(xì)菌。采用超高效液相四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(UPLCQTOF/MS)與MetabolynxTM軟件分析阿魏酸經(jīng)人體糞便混合菌及分離的單菌作用后的代謝產(chǎn)物,共鑒定出了3種代謝產(chǎn)物,分別是氫化產(chǎn)物、去甲基化產(chǎn)物及去甲氧基化產(chǎn)物;此外,篩選出了對(duì)阿魏酸有特殊代謝活性的2種單菌,其中一種為已鑒定了的Bacillus sp.46; 而另一種未知的細(xì)菌則用16S核糖體RNA(16S rRNA)技術(shù)進(jìn)行了鑒定,結(jié)果表明,此細(xì)菌為Enterococcus sp.45。本研究提示腸道細(xì)菌對(duì)阿魏酸有代謝作用且由不同細(xì)菌完成。

    關(guān)鍵詞 阿魏酸; 腸道細(xì)菌; 超高效液相四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

    1 引 言

    人腸道中大約有100多種總數(shù)超過108的細(xì)菌棲息,其中99%為厭氧菌,這些細(xì)菌統(tǒng)稱為“腸內(nèi)細(xì)菌群”,共同構(gòu)成了腸道的微生態(tài)環(huán)境 [1,2 ]。腸道菌群能產(chǎn)生多種藥物代謝酶,主要包括水解酶、氧化還原酶、裂解酶和轉(zhuǎn)移酶等 [3 ]??诜幬镞M(jìn)入腸道后,不可避免地在腸道菌群作用下發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化,產(chǎn)生出具有不同生物活性的代謝產(chǎn)物,因此腸道菌群在人體的藥物代謝活動(dòng)中起著重要作用 [4 ]。

    阿魏酸(Ferulic acid),化學(xué)名為4羥基3甲氧基苯丙烯酸,是阿魏、川芎、當(dāng)歸、升麻、木賊等多種中藥的有效成分之一。藥理實(shí)驗(yàn)表明,阿魏酸具有效抗血小板凝集和血栓、抗氧化,抗腫瘤、抗突變、增加免疫力等多種作用 [5,6 ],已成為臨床常用的活血祛瘀藥物之一。目前,已有大量關(guān)于阿魏酸體內(nèi)代謝研究的報(bào)道 [7,8 ],但有關(guān)人體腸道混合菌及單種細(xì)菌對(duì)阿魏酸的生物轉(zhuǎn)化研究卻鮮有報(bào)道 [9 ]。本研究采集了健康志愿者新鮮糞便, 通過反復(fù)的涂布和培養(yǎng), 最終分離得到69種人體腸道細(xì)菌。采用超高效液相四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(UPLCQTOF/MS) 與MetabolynxTM軟件 [10 ]尋找阿魏酸與人體腸道混合菌及單菌培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物, 并用16S核糖體RNA技術(shù) (16S rRNA)對(duì)具有特殊代謝活性的細(xì)菌進(jìn)行了鑒定, 鑒定出了對(duì)阿魏酸具有代謝活性的細(xì)菌,為全面了解腸道細(xì)菌對(duì)阿魏酸的代謝提供了依據(jù)。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 儀器與試劑

    UPLC AcquityTM系統(tǒng) (Waters公司);SynaptTM QTOF 質(zhì)譜儀 (Waters公司),配有電噴霧離子源 (ESI);Masslynx 4.1質(zhì)譜工作站軟件 (Waters公司);MetaboLynxTM分析軟件(Waters公司);MLS3750型高壓蒸汽滅菌器(SANYO公司);GNP9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司);WD9402A型PCR擴(kuò)增儀(北京六一儀器公司);DYY8C電泳儀(北京六一儀器公司);TGL16B高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);XW80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司);TD2102電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);EPED型超純水系統(tǒng)(南京易普達(dá)易科技發(fā)展有限公司)。

    阿魏酸(中國藥品生物制品檢定所,批號(hào) 110773201012);PfuX7(DNA聚合酶)、Pfu buffer(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液)、dNTPs(4種脫氧核糖核酸)、DNA提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒(上海博亞生物技術(shù)有限公司);乙腈與甲酸為色譜純,其余試劑為分析純。

    準(zhǔn)確稱取阿魏酸對(duì)照品適量,用超純水超聲溶解,配制成2.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液, 4 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2 普通厭氧培養(yǎng)液(GAM)的配制、滅菌

    稱取胰蛋白胨10.00 g,大豆蛋白胨3.00 g,朊胨10.00 g,酵母浸膏5.00 g,血清消化粉13.50 g,牛肝浸出粉1.20 g,牛肉膏2.20 g,葡萄糖3.00 g,KH2PO4 2.50 g,NaCl 3.00 g,可溶性淀粉5.00 g,L半胱氨酸鹽0.30 g,硫代乙醇酸鈉0.30 g,用超純水加熱溶解,調(diào)節(jié)至pH 7.2并最終定容至1000 mL。準(zhǔn)確稱取2.70 g NaCl,用超純水定容至300 mL。將厭氧培養(yǎng)液及生理鹽水在121℃的高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min,冷卻備用 [11 ]。

    2.3 人體腸道菌液的制備及細(xì)菌的分離、培養(yǎng)

    收集健康女性志愿者(受試者無腸道疾病或代謝性疾病史,且在采樣前3個(gè)月內(nèi)未服用過任何抗生素或益生素)的新鮮糞便5.0 g,與生理鹽水按比例1 ∶ 4 (g/mL)比例混合,渦旋2 min制成混懸液,再1000 r/min離心10 min得上清液,即為腸道菌液 [12 ]。 將腸道菌液加到生理鹽水中連續(xù)稀釋,吸取0.1 mL適當(dāng)濃度的稀釋液接種在GAM瓊脂平板上, 均勻涂布,并在37 ℃厭氧培養(yǎng)。經(jīng)過傳代馴化和反復(fù)平板涂布,分離出69種細(xì)菌,標(biāo)號(hào)為sp.1~sp.69并冷凍保存在4℃冰箱中,以便后面研究使用 [13 ]。

    摘 要 研究人體腸道細(xì)菌對(duì)阿魏酸的代謝。采集健康志愿者新鮮糞便,稱重稀釋后厭氧培養(yǎng),通過反復(fù)涂布分離得到69種人體腸道細(xì)菌。采用超高效液相四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(UPLCQTOF/MS)與MetabolynxTM軟件分析阿魏酸經(jīng)人體糞便混合菌及分離的單菌作用后的代謝產(chǎn)物,共鑒定出了3種代謝產(chǎn)物,分別是氫化產(chǎn)物、去甲基化產(chǎn)物及去甲氧基化產(chǎn)物;此外,篩選出了對(duì)阿魏酸有特殊代謝活性的2種單菌,其中一種為已鑒定了的Bacillus sp.46; 而另一種未知的細(xì)菌則用16S核糖體RNA(16S rRNA)技術(shù)進(jìn)行了鑒定,結(jié)果表明,此細(xì)菌為Enterococcus sp.45。本研究提示腸道細(xì)菌對(duì)阿魏酸有代謝作用且由不同細(xì)菌完成。

    關(guān)鍵詞 阿魏酸; 腸道細(xì)菌; 超高效液相四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

    1 引 言

    人腸道中大約有100多種總數(shù)超過108的細(xì)菌棲息,其中99%為厭氧菌,這些細(xì)菌統(tǒng)稱為“腸內(nèi)細(xì)菌群”,共同構(gòu)成了腸道的微生態(tài)環(huán)境 [1,2 ]。腸道菌群能產(chǎn)生多種藥物代謝酶,主要包括水解酶、氧化還原酶、裂解酶和轉(zhuǎn)移酶等 [3 ]。口服藥物進(jìn)入腸道后,不可避免地在腸道菌群作用下發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化,產(chǎn)生出具有不同生物活性的代謝產(chǎn)物,因此腸道菌群在人體的藥物代謝活動(dòng)中起著重要作用 [4 ]。

    阿魏酸(Ferulic acid),化學(xué)名為4羥基3甲氧基苯丙烯酸,是阿魏、川芎、當(dāng)歸、升麻、木賊等多種中藥的有效成分之一。藥理實(shí)驗(yàn)表明,阿魏酸具有效抗血小板凝集和血栓、抗氧化,抗腫瘤、抗突變、增加免疫力等多種作用 [5,6 ],已成為臨床常用的活血祛瘀藥物之一。目前,已有大量關(guān)于阿魏酸體內(nèi)代謝研究的報(bào)道 [7,8 ],但有關(guān)人體腸道混合菌及單種細(xì)菌對(duì)阿魏酸的生物轉(zhuǎn)化研究卻鮮有報(bào)道 [9 ]。本研究采集了健康志愿者新鮮糞便, 通過反復(fù)的涂布和培養(yǎng), 最終分離得到69種人體腸道細(xì)菌。采用超高效液相四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(UPLCQTOF/MS) 與MetabolynxTM軟件 [10 ]尋找阿魏酸與人體腸道混合菌及單菌培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物, 并用16S核糖體RNA技術(shù) (16S rRNA)對(duì)具有特殊代謝活性的細(xì)菌進(jìn)行了鑒定, 鑒定出了對(duì)阿魏酸具有代謝活性的細(xì)菌,為全面了解腸道細(xì)菌對(duì)阿魏酸的代謝提供了依據(jù)。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 儀器與試劑

    UPLC AcquityTM系統(tǒng) (Waters公司);SynaptTM QTOF 質(zhì)譜儀 (Waters公司),配有電噴霧離子源 (ESI);Masslynx 4.1質(zhì)譜工作站軟件 (Waters公司);MetaboLynxTM分析軟件(Waters公司);MLS3750型高壓蒸汽滅菌器(SANYO公司);GNP9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司);WD9402A型PCR擴(kuò)增儀(北京六一儀器公司);DYY8C電泳儀(北京六一儀器公司);TGL16B高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);XW80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司);TD2102電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);EPED型超純水系統(tǒng)(南京易普達(dá)易科技發(fā)展有限公司)。

    阿魏酸(中國藥品生物制品檢定所,批號(hào) 110773201012);PfuX7(DNA聚合酶)、Pfu buffer(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液)、dNTPs(4種脫氧核糖核酸)、DNA提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒(上海博亞生物技術(shù)有限公司);乙腈與甲酸為色譜純,其余試劑為分析純。

    準(zhǔn)確稱取阿魏酸對(duì)照品適量,用超純水超聲溶解,配制成2.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液, 4 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2 普通厭氧培養(yǎng)液(GAM)的配制、滅菌

    稱取胰蛋白胨10.00 g,大豆蛋白胨3.00 g,朊胨10.00 g,酵母浸膏5.00 g,血清消化粉13.50 g,牛肝浸出粉1.20 g,牛肉膏2.20 g,葡萄糖3.00 g,KH2PO4 2.50 g,NaCl 3.00 g,可溶性淀粉5.00 g,L半胱氨酸鹽0.30 g,硫代乙醇酸鈉0.30 g,用超純水加熱溶解,調(diào)節(jié)至pH 7.2并最終定容至1000 mL。準(zhǔn)確稱取2.70 g NaCl,用超純水定容至300 mL。將厭氧培養(yǎng)液及生理鹽水在121℃的高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min,冷卻備用 [11 ]。

    2.3 人體腸道菌液的制備及細(xì)菌的分離、培養(yǎng)

    收集健康女性志愿者(受試者無腸道疾病或代謝性疾病史,且在采樣前3個(gè)月內(nèi)未服用過任何抗生素或益生素)的新鮮糞便5.0 g,與生理鹽水按比例1 ∶ 4 (g/mL)比例混合,渦旋2 min制成混懸液,再1000 r/min離心10 min得上清液,即為腸道菌液 [12 ]。 將腸道菌液加到生理鹽水中連續(xù)稀釋,吸取0.1 mL適當(dāng)濃度的稀釋液接種在GAM瓊脂平板上, 均勻涂布,并在37 ℃厭氧培養(yǎng)。經(jīng)過傳代馴化和反復(fù)平板涂布,分離出69種細(xì)菌,標(biāo)號(hào)為sp.1~sp.69并冷凍保存在4℃冰箱中,以便后面研究使用 [13 ]。

    摘 要 研究人體腸道細(xì)菌對(duì)阿魏酸的代謝。采集健康志愿者新鮮糞便,稱重稀釋后厭氧培養(yǎng),通過反復(fù)涂布分離得到69種人體腸道細(xì)菌。采用超高效液相四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(UPLCQTOF/MS)與MetabolynxTM軟件分析阿魏酸經(jīng)人體糞便混合菌及分離的單菌作用后的代謝產(chǎn)物,共鑒定出了3種代謝產(chǎn)物,分別是氫化產(chǎn)物、去甲基化產(chǎn)物及去甲氧基化產(chǎn)物;此外,篩選出了對(duì)阿魏酸有特殊代謝活性的2種單菌,其中一種為已鑒定了的Bacillus sp.46; 而另一種未知的細(xì)菌則用16S核糖體RNA(16S rRNA)技術(shù)進(jìn)行了鑒定,結(jié)果表明,此細(xì)菌為Enterococcus sp.45。本研究提示腸道細(xì)菌對(duì)阿魏酸有代謝作用且由不同細(xì)菌完成。

    關(guān)鍵詞 阿魏酸; 腸道細(xì)菌; 超高效液相四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

    1 引 言

    人腸道中大約有100多種總數(shù)超過108的細(xì)菌棲息,其中99%為厭氧菌,這些細(xì)菌統(tǒng)稱為“腸內(nèi)細(xì)菌群”,共同構(gòu)成了腸道的微生態(tài)環(huán)境 [1,2 ]。腸道菌群能產(chǎn)生多種藥物代謝酶,主要包括水解酶、氧化還原酶、裂解酶和轉(zhuǎn)移酶等 [3 ]??诜幬镞M(jìn)入腸道后,不可避免地在腸道菌群作用下發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化,產(chǎn)生出具有不同生物活性的代謝產(chǎn)物,因此腸道菌群在人體的藥物代謝活動(dòng)中起著重要作用 [4 ]。

    阿魏酸(Ferulic acid),化學(xué)名為4羥基3甲氧基苯丙烯酸,是阿魏、川芎、當(dāng)歸、升麻、木賊等多種中藥的有效成分之一。藥理實(shí)驗(yàn)表明,阿魏酸具有效抗血小板凝集和血栓、抗氧化,抗腫瘤、抗突變、增加免疫力等多種作用 [5,6 ],已成為臨床常用的活血祛瘀藥物之一。目前,已有大量關(guān)于阿魏酸體內(nèi)代謝研究的報(bào)道 [7,8 ],但有關(guān)人體腸道混合菌及單種細(xì)菌對(duì)阿魏酸的生物轉(zhuǎn)化研究卻鮮有報(bào)道 [9 ]。本研究采集了健康志愿者新鮮糞便, 通過反復(fù)的涂布和培養(yǎng), 最終分離得到69種人體腸道細(xì)菌。采用超高效液相四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(UPLCQTOF/MS) 與MetabolynxTM軟件 [10 ]尋找阿魏酸與人體腸道混合菌及單菌培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物, 并用16S核糖體RNA技術(shù) (16S rRNA)對(duì)具有特殊代謝活性的細(xì)菌進(jìn)行了鑒定, 鑒定出了對(duì)阿魏酸具有代謝活性的細(xì)菌,為全面了解腸道細(xì)菌對(duì)阿魏酸的代謝提供了依據(jù)。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 儀器與試劑

    UPLC AcquityTM系統(tǒng) (Waters公司);SynaptTM QTOF 質(zhì)譜儀 (Waters公司),配有電噴霧離子源 (ESI);Masslynx 4.1質(zhì)譜工作站軟件 (Waters公司);MetaboLynxTM分析軟件(Waters公司);MLS3750型高壓蒸汽滅菌器(SANYO公司);GNP9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司);WD9402A型PCR擴(kuò)增儀(北京六一儀器公司);DYY8C電泳儀(北京六一儀器公司);TGL16B高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);XW80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司);TD2102電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);EPED型超純水系統(tǒng)(南京易普達(dá)易科技發(fā)展有限公司)。

    阿魏酸(中國藥品生物制品檢定所,批號(hào) 110773201012);PfuX7(DNA聚合酶)、Pfu buffer(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液)、dNTPs(4種脫氧核糖核酸)、DNA提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒(上海博亞生物技術(shù)有限公司);乙腈與甲酸為色譜純,其余試劑為分析純。

    準(zhǔn)確稱取阿魏酸對(duì)照品適量,用超純水超聲溶解,配制成2.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液, 4 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2 普通厭氧培養(yǎng)液(GAM)的配制、滅菌

    稱取胰蛋白胨10.00 g,大豆蛋白胨3.00 g,朊胨10.00 g,酵母浸膏5.00 g,血清消化粉13.50 g,牛肝浸出粉1.20 g,牛肉膏2.20 g,葡萄糖3.00 g,KH2PO4 2.50 g,NaCl 3.00 g,可溶性淀粉5.00 g,L半胱氨酸鹽0.30 g,硫代乙醇酸鈉0.30 g,用超純水加熱溶解,調(diào)節(jié)至pH 7.2并最終定容至1000 mL。準(zhǔn)確稱取2.70 g NaCl,用超純水定容至300 mL。將厭氧培養(yǎng)液及生理鹽水在121℃的高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min,冷卻備用 [11 ]。

    2.3 人體腸道菌液的制備及細(xì)菌的分離、培養(yǎng)

    收集健康女性志愿者(受試者無腸道疾病或代謝性疾病史,且在采樣前3個(gè)月內(nèi)未服用過任何抗生素或益生素)的新鮮糞便5.0 g,與生理鹽水按比例1 ∶ 4 (g/mL)比例混合,渦旋2 min制成混懸液,再1000 r/min離心10 min得上清液,即為腸道菌液 [12 ]。 將腸道菌液加到生理鹽水中連續(xù)稀釋,吸取0.1 mL適當(dāng)濃度的稀釋液接種在GAM瓊脂平板上, 均勻涂布,并在37 ℃厭氧培養(yǎng)。經(jīng)過傳代馴化和反復(fù)平板涂布,分離出69種細(xì)菌,標(biāo)號(hào)為sp.1~sp.69并冷凍保存在4℃冰箱中,以便后面研究使用 [13 ]。

    猜你喜歡
    超純水菌液質(zhì)譜
    Synthesis of new non-fluorous 2,2'-bipyridine-4,4'-dicarboxylic acid esters and their applications for metal ions extraction in supercritical carbon dioxide
    小水量超純水制備系統(tǒng)的最佳工藝選擇
    多糖微生物菌液對(duì)油菜吸收養(yǎng)分和土壤氮磷淋失的影響
    氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀在農(nóng)殘檢測(cè)中的應(yīng)用及維護(hù)
    Bonfire Night
    鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)中通過吸光度值測(cè)定菌液濃度的方法研究
    吹掃捕集-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定水中18種揮發(fā)性有機(jī)物
    復(fù)合微生物菌液對(duì)黃瓜生長和抗病蟲性效應(yīng)研究
    上海蔬菜(2015年2期)2015-12-26 05:03:40
    雜銅冶煉廠超純水管路系統(tǒng)的設(shè)計(jì)
    棗霜化學(xué)成分的色譜質(zhì)譜分析
    精品国产乱码久久久久久男人| 妹子高潮喷水视频| 在线观看免费午夜福利视频| 国产伦人伦偷精品视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲中文av在线| 免费在线观看完整版高清| 久久久水蜜桃国产精品网| 99在线人妻在线中文字幕 | 91精品三级在线观看| 天堂√8在线中文| 国产亚洲欧美在线一区二区| 成人免费观看视频高清| 成年动漫av网址| 久久亚洲精品不卡| 两个人免费观看高清视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 99久久人妻综合| 精品久久久久久,| 男女午夜视频在线观看| 国产淫语在线视频| 色在线成人网| 啦啦啦免费观看视频1| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产一区有黄有色的免费视频| av天堂在线播放| 午夜影院日韩av| 欧美av亚洲av综合av国产av| 乱人伦中国视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 婷婷成人精品国产| 国产男靠女视频免费网站| 日本五十路高清| 国产野战对白在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 村上凉子中文字幕在线| 免费看a级黄色片| 中文字幕制服av| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 婷婷精品国产亚洲av在线 | 欧美在线一区亚洲| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 高清黄色对白视频在线免费看| 一级片免费观看大全| 香蕉国产在线看| tocl精华| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 91麻豆av在线| 99久久精品国产亚洲精品| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产精品 欧美亚洲| 久久 成人 亚洲| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 窝窝影院91人妻| 国产99久久九九免费精品| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 午夜两性在线视频| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲 国产 在线| 国产精品影院久久| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 免费黄频网站在线观看国产| 欧美黄色片欧美黄色片| 午夜影院日韩av| 亚洲美女黄片视频| 国产男靠女视频免费网站| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 人人妻人人澡人人看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产精品免费大片| 免费观看精品视频网站| av电影中文网址| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 三上悠亚av全集在线观看| 韩国精品一区二区三区| 国产高清激情床上av| 久久人妻福利社区极品人妻图片| a在线观看视频网站| 国产亚洲欧美98| √禁漫天堂资源中文www| 国产成人精品久久二区二区免费| 一本大道久久a久久精品| 悠悠久久av| 国产成人系列免费观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲九九香蕉| 中文欧美无线码| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| www.熟女人妻精品国产| 一级毛片精品| 欧美性长视频在线观看| 下体分泌物呈黄色| 999精品在线视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲男人天堂网一区| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲成a人片在线一区二区| x7x7x7水蜜桃| 中文字幕最新亚洲高清| 无限看片的www在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 一边摸一边抽搐一进一小说 | 亚洲中文字幕日韩| 少妇粗大呻吟视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| av视频免费观看在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| 国产成人精品无人区| 欧美乱妇无乱码| 久久国产精品人妻蜜桃| 99国产精品99久久久久| 国产精品免费视频内射| 久久久久久人人人人人| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产高清激情床上av| 一进一出好大好爽视频| 99国产综合亚洲精品| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲av电影在线进入| 麻豆国产av国片精品| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲三区欧美一区| 亚洲精品国产区一区二| 美女午夜性视频免费| 捣出白浆h1v1| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 日日夜夜操网爽| 久久香蕉精品热| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲av美国av| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 99riav亚洲国产免费| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 中文字幕高清在线视频| 在线观看66精品国产| 亚洲成人免费av在线播放| www.999成人在线观看| 国产成人精品无人区| 日本vs欧美在线观看视频| 国产高清videossex| 国产亚洲精品一区二区www | 亚洲av第一区精品v没综合| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 91老司机精品| www日本在线高清视频| 97人妻天天添夜夜摸| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲av熟女| 成人手机av| www.熟女人妻精品国产| 香蕉久久夜色| 久久精品国产a三级三级三级| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 久久亚洲真实| 国产亚洲欧美精品永久| 国产亚洲精品一区二区www | 又大又爽又粗| 国产精品 欧美亚洲| 老司机亚洲免费影院| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲五月天丁香| 久久久国产一区二区| 亚洲在线自拍视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 日本wwww免费看| 脱女人内裤的视频| 一二三四在线观看免费中文在| 国产一区有黄有色的免费视频| 黄色视频,在线免费观看| 一级作爱视频免费观看| 欧美精品av麻豆av| 成人永久免费在线观看视频| 久久人人97超碰香蕉20202| 两个人免费观看高清视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 中出人妻视频一区二区| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美黑人欧美精品刺激| 人成视频在线观看免费观看| av网站在线播放免费| 9191精品国产免费久久| 悠悠久久av| 露出奶头的视频| 很黄的视频免费| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产精品影院久久| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 桃红色精品国产亚洲av| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美日韩精品网址| 国产xxxxx性猛交| 久久中文字幕一级| 十分钟在线观看高清视频www| 久久 成人 亚洲| 日韩免费av在线播放| 国产亚洲欧美在线一区二区| 日韩有码中文字幕| 中文字幕高清在线视频| 亚洲全国av大片| 亚洲熟妇熟女久久| 久久午夜亚洲精品久久| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 高清欧美精品videossex| 国产精品久久久av美女十八| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| av福利片在线| 看黄色毛片网站| 国产在线一区二区三区精| 欧美激情极品国产一区二区三区| 免费看十八禁软件| 欧美国产精品一级二级三级| 国产精品1区2区在线观看. | 亚洲一码二码三码区别大吗| 女人被狂操c到高潮| 中文字幕av电影在线播放| 精品电影一区二区在线| videosex国产| 一区二区三区精品91| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 香蕉久久夜色| 午夜福利欧美成人| 啪啪无遮挡十八禁网站| 成人18禁在线播放| 一区二区三区激情视频| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲国产看品久久| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 三上悠亚av全集在线观看| 国产精品九九99| 亚洲熟女精品中文字幕| xxx96com| 12—13女人毛片做爰片一| 久久香蕉国产精品| 无人区码免费观看不卡| 精品国产一区二区久久| 国产精品亚洲av一区麻豆| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 黄色成人免费大全| 成年动漫av网址| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 成年人黄色毛片网站| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| av免费在线观看网站| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产亚洲欧美98| 搡老熟女国产l中国老女人| 精品久久久久久,| 1024视频免费在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 日韩欧美国产一区二区入口| 成在线人永久免费视频| 国产男女内射视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 日本欧美视频一区| 亚洲精华国产精华精| √禁漫天堂资源中文www| 国产一区二区三区视频了| 久久香蕉国产精品| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 男人的好看免费观看在线视频 | 一二三四社区在线视频社区8| 大香蕉久久成人网| 精品高清国产在线一区| 国产高清激情床上av| 麻豆国产av国片精品| 在线国产一区二区在线| 纯流量卡能插随身wifi吗| videosex国产| 在线av久久热| 757午夜福利合集在线观看| 久久中文看片网| 欧美日韩福利视频一区二区| 91精品国产国语对白视频| 乱人伦中国视频| 男女之事视频高清在线观看| 伦理电影免费视频| 在线观看免费视频日本深夜| 日本精品一区二区三区蜜桃| 欧美日韩视频精品一区| 国产99久久九九免费精品| 亚洲伊人色综图| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 午夜成年电影在线免费观看| 国产精品1区2区在线观看. | 在线观看日韩欧美| 在线观看舔阴道视频| 天天影视国产精品| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产97色在线日韩免费| 热99国产精品久久久久久7| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产又色又爽无遮挡免费看| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲在线自拍视频| 乱人伦中国视频| 老鸭窝网址在线观看| 91老司机精品| 男人舔女人的私密视频| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲综合色网址| 激情视频va一区二区三区| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 久久久国产一区二区| 一区二区三区激情视频| 国产午夜精品久久久久久| 性少妇av在线| 9191精品国产免费久久| 在线观看免费视频网站a站| 久久久久国内视频| 真人做人爱边吃奶动态| 久久国产乱子伦精品免费另类| 久久亚洲真实| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲少妇的诱惑av| 国产成人精品无人区| 久久国产精品人妻蜜桃| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美在线一区亚洲| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产深夜福利视频在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| √禁漫天堂资源中文www| 黄色 视频免费看| 午夜亚洲福利在线播放| 搡老乐熟女国产| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 欧美在线一区亚洲| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲国产看品久久| 久久精品91无色码中文字幕| 精品第一国产精品| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 一级片免费观看大全| 亚洲色图综合在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲欧美色中文字幕在线| 桃红色精品国产亚洲av| 在线观看舔阴道视频| av欧美777| 久99久视频精品免费| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 久热这里只有精品99| 在线观看日韩欧美| 超碰成人久久| 1024香蕉在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 激情在线观看视频在线高清 | xxx96com| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 一夜夜www| 91大片在线观看| 国产精品影院久久| 在线观看午夜福利视频| 日本一区二区免费在线视频| 看黄色毛片网站| avwww免费| 一区在线观看完整版| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲久久久国产精品| 夫妻午夜视频| 老熟女久久久| 麻豆av在线久日| 午夜91福利影院| 另类亚洲欧美激情| 久久这里只有精品19| 水蜜桃什么品种好| 欧美黑人欧美精品刺激| 日本一区二区免费在线视频| 757午夜福利合集在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产成人欧美在线观看 | 久久精品成人免费网站| 亚洲情色 制服丝袜| 波多野结衣av一区二区av| 91国产中文字幕| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 捣出白浆h1v1| 日韩欧美在线二视频 | 一区在线观看完整版| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产欧美亚洲国产| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 久久久久久人人人人人| 亚洲av欧美aⅴ国产| 中文字幕av电影在线播放| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 99香蕉大伊视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 精品国内亚洲2022精品成人 | av超薄肉色丝袜交足视频| 99国产精品99久久久久| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 免费不卡黄色视频| 亚洲五月色婷婷综合| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 91大片在线观看| 啦啦啦免费观看视频1| 最新的欧美精品一区二区| 色综合婷婷激情| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产男女超爽视频在线观看| 久久热在线av| 99re在线观看精品视频| 一进一出抽搐动态| 亚洲五月色婷婷综合| 日韩欧美免费精品| 看免费av毛片| av欧美777| 国产成人免费观看mmmm| 一区二区三区激情视频| 日本a在线网址| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 99热国产这里只有精品6| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲人成77777在线视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 在线观看免费日韩欧美大片| 超碰成人久久| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产成人免费观看mmmm| 激情视频va一区二区三区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 午夜91福利影院| 国产午夜精品久久久久久| 精品第一国产精品| 搡老岳熟女国产| 人人妻人人澡人人看| 在线观看日韩欧美| 国产人伦9x9x在线观看| 国产xxxxx性猛交| av片东京热男人的天堂| 悠悠久久av| 麻豆av在线久日| 女性被躁到高潮视频| 视频区欧美日本亚洲| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲片人在线观看| 精品国产一区二区久久| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 黄色怎么调成土黄色| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲全国av大片| 男人操女人黄网站| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产有黄有色有爽视频| 一级毛片高清免费大全| 在线免费观看的www视频| 日韩欧美在线二视频 | 欧美一级毛片孕妇| 99久久人妻综合| 久99久视频精品免费| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产伦人伦偷精品视频| 99国产精品99久久久久| 一二三四社区在线视频社区8| 在线播放国产精品三级| 亚洲少妇的诱惑av| 国产国语露脸激情在线看| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 一边摸一边抽搐一进一出视频| 天天添夜夜摸| 窝窝影院91人妻| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 男人操女人黄网站| 在线观看66精品国产| 交换朋友夫妻互换小说| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 黑丝袜美女国产一区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 老司机午夜十八禁免费视频| 悠悠久久av| 男人的好看免费观看在线视频 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产99久久九九免费精品| 91精品三级在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 精品国产一区二区三区四区第35| 最新在线观看一区二区三区| 婷婷成人精品国产| a级毛片在线看网站| 国产精品久久久久成人av| 免费观看人在逋| 亚洲一区二区三区不卡视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 男男h啪啪无遮挡| 高清视频免费观看一区二区| 欧美大码av| 久久中文看片网| 成人18禁在线播放| 一区福利在线观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 极品少妇高潮喷水抽搐| 制服诱惑二区| 国产亚洲av高清不卡| a级毛片在线看网站| 下体分泌物呈黄色| 最近最新中文字幕大全免费视频| 超碰成人久久| 精品免费久久久久久久清纯 | 亚洲av日韩精品久久久久久密| 怎么达到女性高潮| 99国产精品免费福利视频| 搡老乐熟女国产| 国产不卡av网站在线观看| 制服人妻中文乱码| 国产又色又爽无遮挡免费看| 欧美日韩福利视频一区二区| 999久久久精品免费观看国产| 在线观看免费日韩欧美大片| 一区二区三区激情视频| 成年人黄色毛片网站| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产欧美日韩一区二区精品| 大型黄色视频在线免费观看| 视频在线观看一区二区三区| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 人人妻,人人澡人人爽秒播| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 嫩草影视91久久| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 成人国产一区最新在线观看| 国产麻豆69| 新久久久久国产一级毛片| 久久这里只有精品19| av线在线观看网站| 三级毛片av免费| 精品亚洲成a人片在线观看| 在线av久久热| 在线观看一区二区三区激情| 女人被狂操c到高潮| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲成国产人片在线观看| 美女午夜性视频免费| 国产精品永久免费网站| 国产高清激情床上av| 中文字幕最新亚洲高清| 精品乱码久久久久久99久播| xxxhd国产人妻xxx| 国产一区二区激情短视频| 丝袜美足系列| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲国产精品合色在线| 国产精品久久视频播放| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 最新的欧美精品一区二区| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 中文字幕色久视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲精品国产一区二区精华液| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 在线天堂中文资源库| 亚洲专区字幕在线| 老鸭窝网址在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 欧美色视频一区免费| 国产亚洲精品第一综合不卡| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲色图av天堂| 久久九九热精品免费| 嫩草影视91久久| 极品人妻少妇av视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久影院123| 欧美日本中文国产一区发布| 搡老熟女国产l中国老女人| 男女免费视频国产| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久九九热精品免费| 十八禁高潮呻吟视频| 国产激情久久老熟女| 欧美黄色片欧美黄色片| 成人精品一区二区免费| cao死你这个sao货| 亚洲三区欧美一区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产xxxxx性猛交| 久久久久久久久免费视频了| av有码第一页| 美国免费a级毛片| 1024视频免费在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx|