AB-8大孔吸附樹脂精制蘆柑皮總黃酮及黃酮類化合物的分離

駱黨委，葉 靜，黃雅燕，肖美添*

（華僑大學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361021）

AB-8大孔吸附樹脂精制蘆柑皮總黃酮及黃酮類化合物的分離

駱黨委，葉 靜，黃雅燕，肖美添*

（華僑大學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361021）

目的：研究AB-8大孔吸附樹脂精制蘆柑皮總黃酮的工藝條件及蘆柑皮黃酮類化合物的分離純化。方法：采用AB-8大孔吸 附樹脂動態(tài)法精制蘆柑皮總黃酮，考察上樣液總黃酮質(zhì)量濃度、pH值、上樣流速、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)對吸附解吸性能的影響；然后將精制的蘆柑皮總黃酮經(jīng)硅膠柱層析、半制備高效液相等技術(shù)進(jìn)行分離純化，并根據(jù)理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)鑒定化學(xué)結(jié)構(gòu)。結(jié)果：AB-8大孔樹脂精制蘆柑皮總黃酮的最佳工藝條件為上樣液總黃酮質(zhì)量濃度3.03 mg/mL、上樣液pH 3.0、上樣流速3.0 BV/h、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%，最優(yōu)條件下可使蘆柑皮總黃酮的純度從17.8%提高到63.1%；此外，從精制的蘆柑皮黃酮中分離到8 個黃酮類化合物，分別鑒定為：橘皮素、川陳皮素、4’,5,7,8-四甲氧基黃酮、5-去甲基-橘皮素、橙黃酮、橙浸膏、柚皮苷、橙皮苷。結(jié)論：AB-8大孔樹脂能很好地富集純化蘆柑皮總黃酮，該法簡單、可行；從精制的蘆柑皮黃酮中分離到8 個黃酮類化合物，其 中，4’,5,7,8-四甲氧基黃酮、5-去甲基-橘皮素、橙浸膏、柚皮苷、橙皮苷首次從蘆柑皮中分得。

蘆柑皮；總黃酮；AB-8大孔吸附樹脂

蘆柑（Citrus reticulata Blanco cv. Ponkan）屬蕓香科柑橘屬植物，果肉可食且營養(yǎng)價值高，而蘆柑皮絕大部分卻被棄掉，造成資源浪費(fèi)及環(huán)境的污染。蘆柑皮除水分外，還含有豐富的香精油[1]、果膠[2]、多糖[3]、黃酮類化合物[4]及多種微量元素[5]等。其中，黃酮類化合物是柑橘屬植物的主要活性成分之一，而且在果皮中的含量很高[6]。黃烷酮、黃酮、黃酮醇這3 類化合物是柑橘屬中主要的黃酮類成分，其中多甲氧基黃酮在抗誘變和抗腫瘤方面有著獨(dú)特的潛在價值[6]。

大孔吸附樹脂是一種應(yīng)用比較廣泛的吸附分離介質(zhì)，具有穩(wěn)定性高、吸附選擇性獨(dú)特、富集效果好、解吸條件溫和、不受無機(jī)物影響、再生簡便、使用周期長等優(yōu)點(diǎn)[7]，廣泛應(yīng)用于中藥及天然植物中活性成分（如皂苷、黃酮、內(nèi)脂、生物堿等大分子化合物）的提取分離[8]，尤其用于純化黃酮的報(bào)道最多。近年來已有大孔樹脂用于純化柑橘屬果皮黃酮的報(bào)道[9-12]，研究表明D101和AB-8大孔樹脂分離純化柑橘皮黃酮有較好的效果。石磊等[13]用AB-8大孔樹脂靜態(tài)法精制蘆柑總皮黃酮使其純度達(dá)到51.6%，但有關(guān)動態(tài)吸附解吸性能的研究未見報(bào)道。本研究選擇AB-8大孔吸附樹脂，以蘆柑皮為原料，研究對總黃酮類化合物的動態(tài)吸附和解吸性能，并利用硅膠柱層析、HPLC等技術(shù)分離純化精制的蘆柑皮黃酮，為綜合開發(fā)蘆柑皮資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟蘆柑產(chǎn)地福建永春，采收期2010年12月，由福建省宏順食品飲料有限公司（永春）提供。

蘆丁（生化試劑） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、石油醚、乙酸乙酯、丙酮（均為分析純） 西隴化工股份有限公司；AB-8大孔吸附樹脂 天津南開大學(xué)化工廠；硅膠（100～200、200～300目，化學(xué)純） 青島海洋化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CLF-04中藥粉碎機(jī) 廣州大祥電子機(jī)械設(shè)備有限公司；752N紫外分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；奧利龍酸度計(jì) 美國Thermo有限公司；INOVA-500MHz-FT核磁共振儀、6320型ESI質(zhì)譜儀 美國Agilent公司；1525半制備型高效液相色譜儀（2998光電二極管陣列（photo-diode array，PDA）檢測器） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆柑皮總黃酮的提取

取蘆柑皮70 ℃烘干，粉碎，過30目篩，精密稱取100 g，石油醚脫脂，過濾；濾渣加 2 L 90%乙醇溶液80 ℃回流提取3 次，每次2 h。合并濾液，減壓濃縮，8 000 r/min離心30 min，取上清液，冷凍干燥，得蘆柑皮總黃酮粗提取物。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及總黃酮含量的測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及蘆柑皮總黃酮含量的測定參照《中國藥典》2010版[14]。以吸光度A為縱坐標(biāo)、蘆丁質(zhì)量濃度ρ（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=12.214ρ-0.004，R2=0.999 5。按式（1）計(jì)算總黃酮含量。

式（1）中：ρ為測定樣液的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為原料液的體積/mL；m為原料質(zhì)量/mg。

1.3.3 大孔樹脂的篩選及其預(yù)處理

[13]，選擇AB-8大孔樹脂進(jìn)行動態(tài)法精制蘆柑皮總黃酮的研究，其預(yù)處理方法參照文獻(xiàn)[15]。

1.3.4 動態(tài)吸附泄漏曲線的研究

準(zhǔn)確稱取18 g預(yù)處理過的AB-8大孔樹脂，裝柱后，上樣條件為：蘆柑皮總黃酮質(zhì)量濃度為2.86 mg/mL，pH 3.5，流速為3.0 BV/h（柱床體積約20 mL）；洗脫條件為：洗脫液為90%乙醇，流速為3.0 BV/h；洗脫液每10 mL收集1 管，測其質(zhì)量濃度，以總黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL）為縱坐標(biāo)，洗脫體積（BV）為橫坐標(biāo)繪制動態(tài)吸附泄漏曲線[16]。

1.3.5 AB-8大孔樹脂對蘆柑皮總黃酮的動態(tài)吸附解吸性能的影響

準(zhǔn)確稱取18 g預(yù)處理過的AB-8大孔樹脂，裝柱后，在相同條件下研究上樣液總黃酮質(zhì)量濃度（0.95、1.98、3.03、4.09、4.93 mg/mL）、pH（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0）、上樣流速（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 BV/h）對AB-8大孔樹脂吸附效果的影響；分析解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）對洗脫效果的影響。根據(jù)式（2）～（4）計(jì)算總黃酮得率、吸附率、解吸率：

式（2）～（4）中：ρ1、ρ2、ρ3分別表示原料液、流出液和洗脫液的黃酮質(zhì)量濃 度/（mg/mL）；V1、V2、V3表示原料液、流出液和洗脫液的體積/mL。

1.3.6 AB-8大孔樹脂動態(tài)洗脫特性分析

按確定的最佳吸附和解吸條件上柱洗脫，部分收集洗脫液，每10 mL收集1管，測其質(zhì)量濃度；以洗脫液體積為橫坐標(biāo)，洗脫液中總黃酮質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。

1.3.7 黃酮類化合物的分離純化

精制的蘆柑皮總黃酮，經(jīng)水溶解，乙酸乙酯萃取，濃縮，冷凍干燥，得15 g粉末狀樣品。樣品經(jīng)硅膠柱色譜（石油醚-丙酮，20∶1→0∶1梯度洗脫）得17 個組分（Fr1-17），F(xiàn)r2經(jīng)硅膠柱色譜（石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)，20∶1→0∶1梯度洗脫）得5 個組分：Fr2-1、Fr2-2、Fr2-3、Fr2-4、Fr2-5，F(xiàn)r2-1、Fr2-2、Fr2-3分別再經(jīng)1 次硅膠柱色譜（石油醚-丙酮系統(tǒng)梯度洗脫）和半制備高效液相色譜（甲醇-水）得化合物1（24.5 mg）、化合物2（16.1 mg）、化合物3（8.6 mg）。Fr3經(jīng)硅膠柱色譜（石油醚-丙酮系統(tǒng)，20∶1→0∶1梯度洗脫）得4 個組分：Fr3-1、Fr3-2、Fr3-3、Fr3-4，前3 個組分分別再經(jīng)1 次硅膠柱色譜（石油醚-丙酮系統(tǒng)梯度洗脫）和半制備高效液相色譜（甲醇-水）得化合物4（9.5 mg）、化合物5（9.2 mg）、化合物6（7.9 mg）。Fr4經(jīng)2 次硅膠柱色譜（石油醚-丙酮系統(tǒng)梯度洗脫），再經(jīng)半制備高效液相色譜（甲醇-水），得化合物7（8.2 mg）、化合物8（9.1 mg）。

液相色譜條件：Agilent C18色譜柱 （250 mm× 9.4 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水；流速：2.0 mL/min；柱溫30 ℃；PDA檢測器，檢測波長：220、254、280、360 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 動態(tài)吸附泄漏曲線

圖1 吸附泄漏曲線Fig.1 Breakthrough curve

一般認(rèn)為，泄漏曲線的泄漏點(diǎn)為流出液中總黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到原料液黃酮質(zhì)量濃度的1/10時所流出的體積。如圖1所示，AB-8大孔樹脂的動態(tài)吸附泄漏曲線的泄漏點(diǎn)為2.0 BV。由圖1可知，當(dāng)流出液體積達(dá)到13.5 BV時，蘆柑皮總黃酮質(zhì)量濃度已非常接近原料液中蘆柑皮總黃酮的質(zhì)量濃度，說明此時AB-8大孔樹脂已趨于飽和吸附。由于傳質(zhì)阻力的存在，使得吸附泄漏曲線達(dá)不到理想中的“S”型曲線。

2.2 上樣液總黃酮質(zhì)量濃度的選擇

準(zhǔn)確稱取18 g預(yù)處理過的AB-8大孔樹脂裝柱，上樣條件為：pH 3.5、流速3.0 BV/h；洗脫條件：洗脫液為90%乙醇、流速3.0 BV/h；總黃酮質(zhì)量濃度對吸附的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 總黃酮質(zhì)量濃度對總黃酮得率和含量的影響Fig.2 Effect of sample concentration on the recovery and purity of flavonoids

由圖2可知，上樣液質(zhì)量濃度在3.03 mg/mL左右時，蘆柑皮總黃酮含量和得率都相對較高；當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度低于3.03 mg/mL時，AB-8大孔吸附樹脂有足夠吸附蘆柑皮總黃酮的活性位點(diǎn)，此時總黃酮得率會隨著樣品質(zhì)量濃度的增高而上升；隨著上柱液總黃酮質(zhì)量濃度的不斷增大，雜質(zhì)含量增加，雜質(zhì)會與蘆柑皮黃酮競爭吸附活性位點(diǎn)，導(dǎo)致總黃酮得率減小[17]；此外，實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，原料液質(zhì)量濃度高于3.03 mg/mL時會有流速減慢的現(xiàn)象；這是因?yàn)檫x用的AB-8樹脂的粒徑范圍較細(xì)，為0.3～1.25 mm，隨著上樣液質(zhì)量濃度的增加，發(fā)生多分子層吸附，容易導(dǎo)致樹脂吸附過程中流速減慢[18-19]；綜合考慮，上樣液總黃酮質(zhì)量濃度在3.03 mg/mL左右為佳。

2.3 上樣液pH值的選擇

黃酮類化合物含有酚羥基，呈弱酸性，在酸性條件下可使黃酮類化合物保持分子狀態(tài)，這有利于大孔吸附樹脂對其吸附；在堿性條件下，黃酮類化合物會離子化不利于樹脂對其吸附[20]。準(zhǔn)確稱取18 g預(yù)處理過的AB-8大孔樹脂裝柱，上樣條件為：蘆柑皮總黃酮質(zhì)量濃度3.0 mg/mL、流速3.0 BV/h；洗脫條件：洗脫液為90%乙醇、流速3.0 BV/h；上樣液pH值對吸附的影響結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，當(dāng)pH 3.0的時候，AB-8的吸附效果最好，吸附率高達(dá)80.22%；隨著pH值的增大吸附率反而降低，這可能是因?yàn)閜H值在3.0左右，黃酮分子呈分子狀態(tài)，有利于吸附。原料液pH值為1和2時有顏色變化，可能形成了鹽結(jié)構(gòu)[7]，進(jìn)而導(dǎo)致吸附率偏低。

圖3 上樣液pH值對總黃酮吸附的影響Fig.3 Effect of sample pH on flavonoids adsorption

2.4 上樣流速的選擇

準(zhǔn)確稱取18 g預(yù)處理過的AB-8大孔樹脂裝柱，上樣條件為：蘆柑皮總黃酮質(zhì)量濃度3.0 mg/mL、pH 3.0；洗脫條件：洗脫液90%乙醇溶液、流速3.0 BV/h；上樣流速對吸附的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 上樣流速對總黃酮吸附的影響Fig.4 Effect of sample flow rate on flavonoids adsorption

由圖4可知，隨著上樣流速的增大，AB-8大孔樹脂的吸附率呈下降趨勢，即流出液的總黃酮的質(zhì)量濃度逐漸增大。上樣流速過快，蘆柑皮黃酮溶液與樹脂的接觸時間短，其分子來不及擴(kuò)散到樹脂的內(nèi)表面而發(fā)生漏吸，導(dǎo)致吸附率降低；上樣流速較小時，黃酮分子有足夠多的時間與樹脂內(nèi)表面接觸，有利于AB-8大孔樹脂對蘆柑皮黃酮的吸附，從而可以減少黃酮分子的漏出量，有利于提高樹脂的吸附量。流速過小，會使實(shí)驗(yàn)周期延長，綜合考慮吸附率和實(shí)驗(yàn)時間，選取上樣流速為3.0 BV/h。

2.5 洗脫液體積分?jǐn)?shù)的選擇

準(zhǔn)確稱取18 g預(yù)處理過的AB-8大孔 樹脂裝柱，上樣條件為：蘆柑皮總黃酮質(zhì)量濃度3.0 mg/mL、pH 3.0、流速3.0 BV/h；3.0 BV/h的流速洗脫；洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)對解吸性能的影響結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，隨著解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，解吸率不斷上升；這是因?yàn)楸环蛛x物質(zhì)與樹脂之間具有一定的范德華力，隨著兩種物質(zhì)的極性越相近則范德華力越大。AB-8大孔吸附樹脂為弱極性的樹脂，其吸附的蘆柑皮黃酮極性較小，故乙醇體積分?jǐn)?shù)越高即極性越小則洗脫效果越明顯。考慮到乙醇體積分?jǐn)?shù)增大到一定程度后，解吸率提高不明顯，而大量雜質(zhì)也會隨之洗脫下來，這將使蘆柑皮總黃酮純度下降；綜合考慮，解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇 90%。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮解吸的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on flavonids desorption

2.6 動態(tài)洗脫特性曲線

準(zhǔn)確稱取18 g預(yù)處理過的AB-8大孔樹脂裝柱，按照最佳吸附解吸工藝（上樣液總黃酮質(zhì)量濃度3.03 mg/mL、pH 3.0、流速3.0 BV/h、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)90%）上樣洗脫，AB-8大孔樹脂動態(tài)洗脫特性曲線如圖6所示。

圖6 洗脫曲線Fig.6 Elution curve

由圖6可知，蘆柑皮黃酮的洗脫高峰相對集中，對稱性較好，洗脫性能良好。當(dāng)洗脫液體積為4 BV時，蘆柑皮總黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到最高值，為14 mg/mL；當(dāng)洗脫液體積達(dá)到10 BV時，基本上能將AB-8大孔吸附樹脂吸附的蘆柑皮黃酮全部洗脫。

2.7 精制總黃酮含量的測定

按1.3.1節(jié)方法提取的蘆柑皮總黃酮的純度為17.8%。按上述優(yōu)化的工藝以AB-8大孔樹脂進(jìn)行3 次實(shí)驗(yàn)，精制的蘆柑皮總黃酮純度分別為60.7%、65.4%、63.2%，取其平均值為63.1%，RSD為3.73%。

2.8 單體化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

2.8.1 化合物1

淡黃色針狀結(jié)晶（甲醇）；正離子模式，ESI-MS m/z：373[M+H]+，395[M+Na]+，411[M+K]+。1H-NMR（500 MHz, CD3OD） δ：7.96（2H, d, J=9.0 Hz, H-2’, 6’），7.09（2H, d, J=9.0 Hz, H-3’, 5’），6.65（1H, s, H-3），4.10，4.02，3.92（9 H, s, 3×OCH3），3.89（6H, s, 2×OCH3）；13C-NMR（125 MHz, CD3OD） δ：179.8（C-4），164.5（C-4’），164.0（C-2），153.5（C-7），149.5（C-5），149.3（C-9），145.8（C-6），139.8（C-8），129.2（C-2’, 6’），124.7（C-1’），115.8（C-10），115.5（C-3’, 5’），106.9（C-3），62.8，62.3，56.2（5×OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21-22]報(bào)道的橘皮素?cái)?shù)據(jù)基本一致，故化合物1鑒定為橘皮素。

2.8.2 化合物2

無色針晶（甲醇）；正離子模式，ESI-MS m/z：403[M+H]+，425[M+Na]+，441[M+K]+。1H-NMR（500 MHz, CDCl3） δ：7.61（1H, dd, J1=2.0 Hz, J2=8.50 Hz, H-6’），7.44（1H, d, J=2.0 Hz, H-2’），7.00（1H, d, J= 8.50 Hz, H-5’），6.84（1H, s, H-3），4.12（3H, s, OCH3-5），4.04（3H, s, OCH3-8），3.99（3H, s, OCH3-6），3.97（3H, s, OCH3-7），3.96（6H, s, OCH3-3’, 4’）；13C-NMR（125 MHz, CDCl3） δ：177.4（C-4），161.8（C-2），152.3（C-7），151.8（C-9），149.4（C-5），148.4（C-4’），147.7（C-3’），144.3（C-6）, 137.9（C-8），123.7（C-1’），120.08（C-6’），114.3（C-5’），111.3（C-2’），108.7（C-10），106.3（C-3），62.3（5-C），62.0（6-C），61.8（7-C），61.7（8-C），56.1（4’-C），56.0（3’-C）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22-23]中川陳皮素一致，故鑒定化合物2為川陳皮素。

2.8.3 化合物3

淺黃色針狀結(jié)晶（甲醇）；正離子模式，ESIMS m/z：343[M+H]+，365[M+Na]+，381[M+K]+。1H-NMR（500 MHz, CDCl3）δ：7.96（2H, d, J=8.0 Hz, H-2’,6’），7.10（2H, d, J=9.0 Hz, H-3’, 5’），6.68（1H, s, H-8），6.61（1H, s, H-3），4.01（3H, s, OCH3-5），3.95（3H, s, OCH3-7 ），3.92（3H, s, OCH3- 8），3.89（3H, s, OCH3-4’）；13C-NMR（125 MHz, CDCl3）δ：180.4（C-4），164.4（C-2），163.5（C-4’），159.0（C-7），157.9（C-5），153.2（C-9），132.0（C-6），129.2（C-2’, 6’），124.7（C-1’），115.8（C-3’, 5’），109.1（C-10），106.9（C-3），94.4（C-8），62.1，57.1，56.8，56.2（4×OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道的4’,5,7,8-四甲氧基黃酮數(shù)據(jù)一致，故化合物3鑒定為4’,5,7,8-四甲氧基黃酮。

2.8.4 化合物4

淡黃色針狀結(jié)晶（甲醇）；正離子模式，ESI-MS m/z：359[M+H]+，381[M+Na]+，397[M+K]+。1H-NMR（500 MHz, CDCl3）δ：12.35（1H, s, 5-OH），7.91（2H, d, J=8.8 Hz, H-2’,6’），7.05（2H, d, J= 8.8 Hz, H-3’, 5’），6.61（1H, s, H-3），4.12，3.99，3.96，3.91（12H, s, 4×OCH3）。13C-NMR （500 MHz, CDCl3）δ：183.5（C-4），164.5（C-4），163.1（C-2）, 153.2（C-7），145.0（C-5），146.2（C-9），136.9（C-6），133.4（C-8）, 128.4（C-2,6），123.8（C-1），114.9（C-3, 5），107.3（C-10），104.1（C-3），62.4，62.0，61.4，55.8（4×OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道的5-去甲基-橘皮素?cái)?shù)據(jù)一致，故化合物4鑒定為5-去甲基-橘皮素。

2.8.5 化合物5

無色針狀結(jié)晶（甲醇）；正離子模式，ESI-MS m/z：373[M+H]+，395[M+Na]+。1H-NMR （500 MHz, CDCl3）δ：7.62（1 H, d, J=8.5 Hz, H-6’），7.36（1H, s, H-2’），6.92（1H, d, J=8.5 Hz, H-5’），6.63（1H, s, H-8），6.37（1H, s, H-3），3.95，3.92，3.90（9H, s, 3×OCH3），3.89（6H, s, 2×OCH3）；13C NMR（500 MHz, CDCl3）δ：177.7（C-4），161.8（C-2），157.3（C-7），154.4（C-9），152.6（C-5），149.9（C-4’），149.4（C-3’），141.0（C-6），120.9（C-1’），120.3（C-6’），111.8（C-5’），109.4（C-2’），108.1（C-3），107.8（C-10），97.0（C-8），62.8，62.2，57.0，56.9，56.8（5×OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25-26]報(bào)道的橙黃酮（5,6,7,3’,4’-pentamethoxyflavone）數(shù)據(jù)基本一致，故化合物5鑒定為橙黃酮。

2.8.6 化合物6

無色針狀結(jié)晶（甲醇）；正離子模式，ESI-MS m/z：373[M+H]+，395[M+Na]+。1H-NMR（500 MHz, CDCl3）δ：7.91（2H, d, J=8.8 Hz, H-2’,6’），7.01（2H, d, J=8.8 Hz, H-3’,5’），6.58（1H, s, H-5），4.01（3H, s, OCH3），4.00（3H, s, OCH3），3.99（6H, s, 2×OCH3），3.89（3H, s, OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27]報(bào)道的橙浸膏數(shù)據(jù)基本一致，故化合物6鑒定為橙浸膏。

2.8.7 化合物7

白色結(jié)晶粉末（氯仿）；正離子模式，ESI-MS m/z：581[M+H]+。1H-NMR （500 MHz, DMSO-d6）δ：12.10（1H, s, 5-OH），9.59（1H, s, 4’-OH），7.35（2H, d, J=8.0 Hz, H-2’,6’），6.80（2H, d, J=8.0 Hz, H-3’,5’），6.14（1H, d, J=2.5 Hz, H-8），6.12（1H, d, J=2.0 Hz, H-6），5.50（1H, centred t, J=5.5 Hz, H-2），5.3（1H, d, J=8.2 Hz, 葡萄糖, H-1’），5.2（1H, d, J=2.2 Hz, 鼠李糖, H-1’’），3.8（2H, m, H-6’），3.2-3.7（14H, m, 鼠李糖和葡萄糖, H），1.2（3H, d, J=6.6 Hz 鼠李糖CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[28]報(bào)道的柚皮苷數(shù)據(jù)基本一致，故化合物7鑒定為柚皮苷。

2.8.8 化合物8

淡黃色結(jié)晶粉末（氯仿）；正離子模式，ESI-MS m/z：611[M+H]+。1H-NMR（500 MHz, DMSO-d6）δ：12.0（1H, s, 5-OH），9.1（1H, s, 3’-OH），6.95（1H, d, J=2.0 Hz, H-2’），6.93（1H, d, J=8.0 Hz, H-5’），6.91（1H, dd, J=2.0 Hz, 8.0 Hz, H-6’），6.15（1H, d, J=2.0 Hz, H-8），6.12（1H, d, J=2.0 Hz, H-6），4.98（1H, d, J=7.4 Hz, 葡萄糖H-1’），4.52（1H, s, 鼠李糖, H-1’’），3.77（3H, s, OCH3-4’），3.52-3.65（2H, m, H- 6’），3.2-3.6（7H, m, 鼠李糖和葡萄糖, H），3.14（1H, m, H-3b），2.79（1H, m, H-3a），1.08（3H, m, 鼠李糖-CH3）；13C NMR（125 MHz, DMSO-d6）δ：196.7（C-4），164.9（C-7），162.6（C-5），162.0（C-9），130.4（C-l’），146.1（C-3’），147.6（C-4’），117.5（C-6’），113.9（C-2’），111.7（C-5’），102.9（C-10），100.2（C-1’’），99.0（C-l’），95.9（C-6），95.2（C-8），78.0（C-2），75.9（C-3’），75.2（C-5’），72.7（C-2’），71.6（C-4’’），69.9（C-3’’），69.8（C-2’’），69.1（C-4’），67.9（C-5’’），65.7（C-6’），55.3（OCH3），41.7（C-3），17.5（C-6’’）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[28-29]報(bào)道的橙皮苷數(shù)據(jù)基本一致，故化合物8鑒定為橙皮苷。

3 結(jié) 論

AB-8大孔樹脂能很好地富集純化蘆柑皮總黃酮，其最佳吸附解吸工藝為：上樣液總黃酮質(zhì)量濃度3.03 mg/mL、pH 3.0、流速3.0 BV/h、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，最佳工藝可使蘆柑皮總黃酮的純度由粗提物的17.8%提高到63.1%。該法工藝簡單，成本低，易操作，適合工業(yè)化生產(chǎn)。此外，從精制的蘆柑皮黃酮中分離到8 個黃酮類化合物，分別鑒定為：橘皮素、川陳皮素、4’,5,7,8-四甲氧基黃酮、5-去甲基-橘皮素、橙黃酮、橙浸膏、柚皮苷、橙皮苷，其中，4’,5,7,8-四甲氧基黃酮、5-去甲基-橘皮素、橙浸膏、柚皮苷、橙皮苷為首次從蘆柑皮中分得。

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Purification of Total Flavonoids Extracted from Ponkan (Citrus reticulata Blanco cv. Ponkan) Peel by AB-8 Macroporous Adsorption Resin and Separation of Flavonoid Constituents

LUO Dang-wei, YE Jing, HUANG Ya-yan, XIAO Mei-tian*
(College of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, China)

Objective: To propose an optimal purif i cation process for fl avonoids extracted from ponkan (Citrus Reticulata Blanco cv. Ponkan) peel. Methods: The dynamic adsorption and desorption performance of AB-8 macroporous resin towards flavonoids extracted from ponkan peel was investigated. Major process parameters including sample concentration, pH, fl ow rate, and elution ethanol concentration were evaluated. Then the purif i ed fl avonoids were isolated by chromatographic methods with silica gel and semi-preparative HPLC, and the structures were elucidated on the basis of physicochemical pro perties and spectral data analysis. Results: The optimal purif i cation process was determined as follows: samples at pH 3.0 conta ining 3.03 mg/mL ponan peel fl avonoids were loaded onto the column at a fl ow rate of 3.0 BV/h, and then 90% ethanol was passed through the column to elute the bound flavonoids. After the purification, the purity of ponan peel fl avonoids was increased from 17.8% to 63.1%. In addition, eight compounds were isolated from the purif i ed fl avonoids and identif i ed as tangeretin, nobiletin, 4′,5,7,8-tetramethyl-O-isoscutellarein, 5-demethyl-tangeretin, sinetsetin, aurantine, naringin, and hesperidin. Conclusion: AB-8 macroporous resin has a high performance in enriching and purifying fl avonoids from ponkan peel, providing a simple and feasible method. Eight compounds can be isolated from the purif i ed fl avonoids. Moreover, 4′,5,7,8-tetramethyl-O-isoscutellarein, 5-demethyl-tangeretin, aurantine, naringin, and hesperidin are first reported from ponkan peel.

Citrus reticulata Blanco cv. Ponkan peel; flavonoids; AB-8 macroporous adsorption resin

Q946.8；R284

A

1002-6630（2014）06-0030-06

10.7506/spkx1002-6630-201406006

2013-04-12

泉州市重大科技專項(xiàng)（2008ZD17）

駱黨委（1985—），男，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：kukuleleyunyun@126.com

*通信作者：肖美添（1968—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：mtxiao@hqu.edu.cn