HPLC法測定鼻康合劑中綠原酸的含量

柯昌毅，謝鳳英，謝劍鋒，李 揚（重慶市第三人民醫(yī)院，重慶 400014）

蒼耳子系菊科植物蒼耳Xanthium sibiricumPart.的干燥成熟帶總苞的果實[1-2]，為中醫(yī)臨床常用藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有散風(fēng)除濕、通鼻開竅的功效，用于治療風(fēng)寒頭痛、鼻淵流涕、風(fēng)疹瘙癢和濕痹拘攣等證[3-5]。我院以蒼耳子為主藥，制備成鼻康合劑，用于治療急、慢性鼻炎及副鼻竇炎，效果較好。由于蒼耳子的主要活性成分為酚酸類化合物[6]，其中綠原酸為主要成分[7]，故本試驗建立了以高效液相色譜（HPLC）法測定鼻康合劑中綠原酸含量的方法[8-9]，旨在為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究以及用藥安全提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，含四元泵、1260型化學(xué)工作站（美國安捷倫公司）；AR224CN型萬分之一電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]；UV-2450型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）。

1.2 藥品與試劑

鼻康合劑（重慶市第三人民醫(yī)院制劑室，批號：20120509、20120510、20120511）；綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-200413，供含量測定用）；甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為注射用水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[1]與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，10 μm）；流動相：0.5%磷酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～20 min，80%A→60%A；＞20～50 min，60%A→50%A；＞50～60 min，50%A→80%A）；檢測波長：327 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。理論板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于3 000；綠原酸與相鄰雜質(zhì)峰的分離度＞1.5。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對照品10.41 mg，置100 ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，即得質(zhì)量濃度為104.10 μg/ml的對照品貯備液，搖勻，備用。精密量取對照品貯備液2 ml，置5 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為?41.64 μg/ml的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取鼻康合劑（批號：20120509）2 ml，置于25 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取綠原酸對照品貯備液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 ml，分別置于10 ml棕色量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為5.20、10.41、20.82、41.64、62.46 μg/ml的系列對照品溶液。分別取上述溶液按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為20 μl。以對照品溶液質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝0.013 5x－0.304 7（r＝0.999 9，n＝5）。結(jié)果表明，綠原酸質(zhì)量濃度在5.20～62.46 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

取綠原酸對照品溶液（41.64 μg/ml）20 μl，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積。結(jié)果顯示，綠原酸的平均峰面積積分值為1 874.4，RSD＝0.74%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液（批號：20120509）適量，室溫下放置12 h，分別于0、2、4、6、8、10、12 h按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，測定峰面積。結(jié)果顯示，綠原酸的平均峰面積積分值為1 802.0，RSD＝0.16%（n＝7），表明室溫條件下供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取鼻康合劑樣品（批號：20120509）適量，共6份，精密量取，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，測定峰面積，計算樣品含量。結(jié)果顯示，6份樣品中綠原酸的平均質(zhì)量濃度為0.303 0 mg/ml，RSD＝1.34%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密量取已測定質(zhì)量濃度（0.303 0 mg/ml）的同一批（批號：20120509）樣品9份，各1.0 ml，每3份為一組，分別按低、中、高質(zhì)量濃度精密加入適量綠原酸對照品貯備液，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.9 樣品含量測定

分別精密量取3批鼻康合劑各2 ml，按“2.3”項下方法制備供試品溶液。精密量取供試品溶液與對照品溶液各20 μl，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，測定峰面積，以峰面積計算樣品中綠原酸的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

在檢測波長的選擇中，取綠原酸對照品10 mg，置50 ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 ml，置100 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 ml含綠原酸10 μg的溶液。照分光光度法[2]測定，以50%甲醇為空白對照，在波長200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，可得綠原酸在327 nm波長處有較強吸收（吸光度為0.558），故確定檢測波長為327 nm。紫外掃描曲線見圖2。

圖2 對照品在波長200～400 nm范圍內(nèi)的紫外掃描曲線Fig 2 Scanning absorption curves of substance control in the wavelength range of 200-400 nm

在流動相的選擇中，筆者主要考察了甲醇-磷酸系統(tǒng)和乙腈-磷酸系統(tǒng)對色譜峰的影響。結(jié)果表明，甲醇-磷酸系統(tǒng)的分離效果較好，因此選擇甲醇-0.5%磷酸溶液為流動相，進(jìn)行梯度洗脫。

綜上所述，本方法簡單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于鼻康合劑的質(zhì)量控制。

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[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：151、附錄30.

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