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    七葉皂苷鈉對(duì)急性肺損傷模型大鼠的保護(hù)作用

    2014-12-03 03:07:22王岑立陳淑梅李曉雯周廣葉小群寧波鎮(zhèn)海第二醫(yī)院浙江寧波35207南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院南昌330006
    中國(guó)藥房 2014年15期
    關(guān)鍵詞:對(duì)模型皂苷鈉肺水腫

    王岑立,陳淑梅,李曉雯,周廣,葉小群(.寧波鎮(zhèn)海第二醫(yī)院,浙江寧波35207;2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院,南昌 330006)

    急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)是臨床常見危重癥,病死率高。雖然導(dǎo)致急性肺損傷病因多樣,如嚴(yán)重感染、休克、創(chuàng)傷等,但各種原因引起的急性肺損傷具有共同的病理基礎(chǔ),即肺泡毛細(xì)血管急性損傷,通透性增強(qiáng),肺間質(zhì)淤血、滲出、水腫,肺泡透明膜形成和肺泡萎縮,從而造成肺通氣與血比例失調(diào),分流量增加,導(dǎo)致嚴(yán)重缺氧狀態(tài)[1]?,F(xiàn)今已對(duì)急性肺損傷進(jìn)行大量基礎(chǔ)和臨床研究,但干預(yù)手段和方法較有限。七葉皂苷是由歐洲七葉樹、日本七葉樹、中華七葉天師栗的果實(shí)娑羅子中提取的一類三萜皂苷化合物,具有減緩組織水腫、恢復(fù)血管通透性、抗炎等功效,臨床上廣泛應(yīng)用于各種原因引起的肺水腫、創(chuàng)傷或手術(shù)所致腫脹的治療;最近研究發(fā)現(xiàn)七葉皂苷鈉可保護(hù)上皮細(xì)胞,減輕低氧和炎癥對(duì)其的損傷[2],故筆者推測(cè)七葉皂苷鈉可能減緩急性肺損傷。本研究旨在通過油酸致大鼠急性肺損傷模型觀察七葉皂苷鈉對(duì)其的保護(hù)作用。

    1 材料

    1.1 儀器

    Allegra 25R型離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司);ELX800型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司);202-00A型電熱恒溫烤箱(上海葉拓儀器儀表有限公司);CKX3型倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);1658型蛋白電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

    1.2 藥品與試劑

    七葉皂苷鈉注射液(哈爾濱圣泰制藥股份有限公司,批號(hào):2010060202);腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒(美國(guó)Sigma公司);水通道蛋白(AQP)1兔抗鼠抗體(武漢博士德生物工程有限公司);超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司)。

    1.3 動(dòng)物

    清潔級(jí)SD大鼠45只,♀♂兼用,體質(zhì)量200~250 g,購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院動(dòng)物房[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SCXK(渝)2009-004]。

    2 方法

    2.1 復(fù)制模型與分組、給藥

    大鼠尾靜脈緩慢注射油酸(0.1 ml/kg)以復(fù)制急性肺損傷模型。45只SD大鼠隨機(jī)均分為3組,即正常對(duì)照(等容生理鹽水)組、模型(等容生理鹽水)組、七葉皂苷鈉(5 mg/kg)組,復(fù)制模型30 min后尾iv給藥,

    2.2 大鼠肺組織濕/干質(zhì)量比(W/D)的測(cè)定

    大鼠尾iv給藥12 h后,麻醉開胸,剪取右肺上葉相同部位,用濾紙吸去水分和血跡稱濕質(zhì)量,再置電熱恒溫烤箱中,烘烤48 h至干質(zhì)量恒定稱質(zhì)量,計(jì)算W/D。

    2.3 肺組織病理學(xué)觀察

    大鼠處死后,剪取左肺,切0.5 cm3組織塊,4%多聚甲醛固定24 h,組織脫水12 h,石蠟包埋,HE染色,光鏡下觀察大鼠肺組織病理學(xué)。

    2.4 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)大鼠血清TNF-α含量

    大鼠處死前取動(dòng)脈血2 ml,室溫自然凝固10~20 min,以離心半徑為25 cm、3 500 r/min離心20 min,得血清,-70℃貯藏,備用。按ELISA測(cè)試盒說明書步驟進(jìn)行檢測(cè)。

    2.5 Western blot法檢測(cè)大鼠肺組織AQP1蛋白的表達(dá)

    大鼠處死后,分離相同肺組織,提取總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。制備SDS-PAGE凝膠,每孔加樣40 μg進(jìn)行電泳。300 mA濕轉(zhuǎn)25 min,將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h,分別加入兔抗鼠AQP1抗體(1∶100,V/V)及兔抗GAPDH抗體(1∶5 000,V/V)的稀釋液中4℃過夜,用TBST洗滌3次,每次5 min,然后放入二抗(辣根酶標(biāo)記山羊抗兔,1∶5 000,V/V)室溫孵育1 h,TBST洗滌3次,每次5 min,用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。所得蛋白條帶圖片使用Image-Pro Plus 10.0進(jìn)行分析,以同一標(biāo)本GAPDH的產(chǎn)物光密度(OD)作為內(nèi)參,校正各自目的蛋白的OD,按公式(相對(duì)值=目標(biāo)蛋白產(chǎn)物的OD/GAPDH的OD)計(jì)算出相對(duì)值。

    2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)以±s表示,采用SPSS13.0軟件處理分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。兩組均數(shù)間比較用配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 七葉皂苷鈉對(duì)模型大鼠肺組織W/D的影響

    與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠肺組織W/D升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,七葉皂苷鈉組大鼠肺組織W/D降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。七葉皂苷鈉對(duì)模型大鼠肺組織W/D的影響見表1。

    3.2 七葉皂苷鈉對(duì)模型大鼠肺組織病理切片的影響

    正常對(duì)照組大鼠肺泡腔內(nèi)無分泌物,肺泡壁結(jié)構(gòu)完整,無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及紅細(xì)胞滲出;模型組大鼠肺組織變化明顯,可見肺間質(zhì)及肺泡水腫,肺泡腔內(nèi)有漿液性滲出物及大量炎性細(xì)胞、紅細(xì)胞滲出,部分肺間隔增厚;七葉皂苷鈉組大鼠肺組織水腫程度明顯下降,肺泡腔內(nèi)炎癥細(xì)胞滲出減輕。大鼠肺組織病理切片見圖1。

    表1 七葉皂苷鈉對(duì)模型大鼠肺組織W/D的影響(±s,n=15)Tab 1 Effects of aescinate sodium on W/D of model rats(±s,n=15)

    表1 七葉皂苷鈉對(duì)模型大鼠肺組織W/D的影響(±s,n=15)Tab 1 Effects of aescinate sodium on W/D of model rats(±s,n=15)

    與正常對(duì)照組比較:*P<0.05;與模型組比較:#P<0.05vs.normal control group:*P<0.05;vs.model group:#P<0.05

    組別正常對(duì)照組模型組七葉皂苷鈉組W/D 3.57±0.20 6.13±0.51*4.82±0.36#劑量,mg/kg 5

    圖1 大鼠肺組織病理切片F(xiàn)ig 1 Histological detection of lung tissue in rats

    3.3 七葉皂苷鈉對(duì)模型大鼠血清TNF-α含量的影響

    與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠血清TNF-α含量增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,七葉皂苷鈉組大鼠血清TNF-α含量減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。七葉皂苷鈉對(duì)模型大鼠血清TNF-α含量的影響見表2。

    表2 七葉皂苷鈉對(duì)模型大鼠血清中TNF-α含量的影響(±s,n=15)Tan 2 Effects of aescinate sodium on TNF-α concentration in serum of model rat(s±s,n=15)

    表2 七葉皂苷鈉對(duì)模型大鼠血清中TNF-α含量的影響(±s,n=15)Tan 2 Effects of aescinate sodium on TNF-α concentration in serum of model rat(s±s,n=15)

    與正常對(duì)照組比較:*P<0.05;與模型組比較:#P<0.05vs.normal control group:*P<0.05;vs.model group:#P<0.05

    組別正常對(duì)照組模型組七葉皂苷鈉組TNF-α,ng/L 120.43±4.31 184.31±6.35*163.02±5.45#劑量,mg/kg 5

    3.4 七葉皂苷鈉對(duì)模型大鼠肺組織AQP1蛋白表達(dá)的影響

    與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠肺組織AQP1蛋白表達(dá)增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,七葉皂苷鈉組大鼠肺組織AQP1蛋白表達(dá)減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AQP1蛋白的表達(dá)見圖2。

    4 討論

    急性肺損傷是一組以肺容積減少、肺順應(yīng)性降低、嚴(yán)重的通氣/血流比例失調(diào)為病理生理特征的病變,其病理基礎(chǔ)是通透性肺水腫,表現(xiàn)為急性進(jìn)行性加重的呼吸困難、頑固性低氧血癥及肺水腫,其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明,尚無有效的治療及阻止病程進(jìn)展的良好方法[1]。臨床雖采取機(jī)械通氣及支持對(duì)癥為主的傳統(tǒng)治療,但由于缺乏早期、敏感的診斷指標(biāo),病死率接近40%。因此,通過檢測(cè)其早期血清及肺組織的炎性相關(guān)因子或蛋白(如TNF-α、AQP1)對(duì)急性肺損傷的診斷與治療具有積極的意義。

    圖2 AQP1蛋白的表達(dá)Fig 2 Protein expression of AQP1

    七葉皂苷鈉是從七葉樹科植物天師栗的干燥成熟種子中獲取的三萜皂苷化合物,可降低毛細(xì)血管通透性、抗?jié)B出及增加靜脈張力、抗炎和改善血液循環(huán)。研究證實(shí),七葉皂苷鈉在治療毛細(xì)血管通透性增高的疾病中具有類似地塞米松的持久抗炎作用,同時(shí)與之相比并無明顯提高脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及血清TNF-α水平等效應(yīng)[2]。研究表明,七葉皂苷鈉具有抗氧化、清除自由基功能,可減少組織細(xì)胞能量的消耗,維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能,并且七葉皂苷鈉可通過激活內(nèi)皮細(xì)胞,增加對(duì)中性粒細(xì)胞的黏附性而減少中性粒細(xì)胞的滲出,有效減少活性氧的生成和清除氧自由基[3]。此外,研究還發(fā)現(xiàn),七葉皂苷鈉還可增強(qiáng)血管壁張力和收縮性,改善微循環(huán),促進(jìn)淋巴回流,改善毛細(xì)血管血液淤滯狀態(tài),明顯增強(qiáng)胸部淋巴流速[4]。這些作用機(jī)制有助于改善肺水腫,減少肺泡液體滲出及促進(jìn)液體從肺毛細(xì)血管的重吸收。

    本研究結(jié)果表明,與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠肺組織中肺泡腔內(nèi)炎性細(xì)胞滲出增加,且W/D、TNF-α含量明顯上升,AQP1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。與模型組比較,七葉皂苷鈉組大鼠肺組織W/D降低,提示大鼠肺組織含水量明顯下降,揭示七葉皂苷鈉對(duì)減輕模型大鼠肺水腫有一定意義。其作用機(jī)制可能與以下相關(guān):(1)七葉皂苷鈉系含多酯鍵的三萜皂苷化合物,可觸發(fā)血漿促腎上腺皮質(zhì)激素、皮質(zhì)類固醇及其受體的釋放,有利于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PMEC)屏障的修復(fù),改善微循環(huán)及組織血供,消除局部腫脹[5-6];(2)清除氧自由基,抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[6];(3)皮質(zhì)類固醇及其受體的釋放引發(fā)下游前列腺素F2α的分泌,拮抗前列腺素(PGE)1、緩激肽及5羥色胺(5-HT)等炎性介質(zhì),發(fā)揮抗炎、抗水腫作用[7]。

    隨著急性肺損傷的進(jìn)一步研究,AQP在肺水腫進(jìn)展中的作用越來越受到重視。到目前為止,在人類各組織上共發(fā)現(xiàn)13種不同的AQP,其中表達(dá)于呼吸系統(tǒng)的有6種(AQP1、AQP3、AQP4、AQP5、AQP8、AQP9),分別表達(dá)于呼吸系統(tǒng)的不同部位[8-9]。AQP1是最早發(fā)現(xiàn)且對(duì)其結(jié)構(gòu)研究最清楚的水通道蛋白,廣泛分布于PMEC中,是水分子的快速轉(zhuǎn)運(yùn)通道,在病理?xiàng)l件下與肺組織液體轉(zhuǎn)運(yùn)息息相關(guān),參與了多種肺水腫疾病的進(jìn)展,且在肺組織中的表達(dá)受TNF-α的調(diào)控[10]。各類原因?qū)е碌募毙苑螕p傷不僅造成PMEC屏障的破壞,同時(shí)伴隨肺組織水轉(zhuǎn)運(yùn)的失衡。然而,針對(duì)AQP的表達(dá)仍有分歧。以往的研究發(fā)現(xiàn),TNF-α與AQP1呈負(fù)相關(guān),急性肺損傷時(shí)位于PMEC的AQP1表達(dá)下調(diào),可致使肺泡-毛細(xì)血管間水轉(zhuǎn)運(yùn)受阻,大量液體積聚肺泡腔及肺間質(zhì)[11]。然而Lai KM等[12]研究發(fā)現(xiàn),炎癥因子亦可誘導(dǎo)AQP1上調(diào)表達(dá);Alexander JJ等[13]的研究指出,在膿毒血癥致大鼠腦損傷模型中,TNF-α可通過TNF受體1上調(diào)AQP4的表達(dá),引起腦水腫等,與Jang AS等[14]在博來霉素誘發(fā)的肺損傷中AQP5上調(diào)表達(dá)相一致。在本研究中,七葉皂苷鈉組大鼠肺組織TNF-α和AQP1蛋白表達(dá)較模型組都有明顯下降,可推測(cè)七葉皂苷鈉可能通過抑制血清TNF-α的產(chǎn)生,繼而影響AQP1蛋白表達(dá),從而達(dá)到減輕肺水腫的目的,但其機(jī)制仍不清楚。AQP的表達(dá)高低可能與損傷的部位及作用時(shí)間有關(guān),但尚需嚴(yán)密的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

    綜上所述,七葉皂苷鈉可有效抑制急性肺損傷,其可能是通過抑制TNF-α間接下調(diào)AQP1的表達(dá)從而輕肺水腫程度,但其分子機(jī)制仍需深入研究。

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