縫隙連接在自發(fā)性高血壓大鼠腎葉間動(dòng)脈收縮增強(qiáng)中的作用

張 雯，馬克濤，2，劉衛(wèi)東，王 洋，李 麗，2，司軍強(qiáng)，2

縫隙連接在自發(fā)性高血壓大鼠腎葉間動(dòng)脈收縮增強(qiáng)中的作用

張 雯1，馬克濤1，2，劉衛(wèi)東1，王 洋1，李 麗1，2，司軍強(qiáng)1，2

目的探討腎葉間動(dòng)脈（RIA）的縫隙連接（GJ）在自發(fā)性高血壓病中的變化。方法應(yīng)用壓力肌動(dòng)圖技術(shù)觀察自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）及Wistar大鼠RIA對內(nèi)皮非依賴血管收縮劑氯化鉀（KCl）和苯腎上腺素（PE）的收縮反應(yīng)的差異，以及應(yīng)用GJ阻斷劑后血管收縮反應(yīng)的變化。應(yīng)用Western blot技術(shù)比較SHR及Wistar大鼠RIA連接蛋白45（Cx45）的表達(dá)差異。結(jié)果①KCl和PE誘導(dǎo)SHR RIA的收縮反應(yīng)要強(qiáng)于Wistar大鼠，應(yīng)用GJ阻斷劑18β-甘草次酸（18β-GA）（100 μmol／L）干預(yù)后，KCl和PE引起的RIA血管的收縮明顯降低，SHR較Wistar大鼠收縮降低幅度更為顯著。②SHR大鼠RIA Cx45蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。結(jié)論SHR RIA收縮作用的增強(qiáng)可能是通過上調(diào)Cx45增強(qiáng)平滑肌細(xì)胞間GJ通訊引起的。

自發(fā)性高血壓大鼠；縫隙連接；腎臟葉間動(dòng)脈；連接蛋白；壓力肌動(dòng)圖技術(shù)

原發(fā)性高血壓是一種常見的心血管疾病［1］，可引發(fā)心、腦、腎損害及周圍血管功能障礙。腎臟不僅在血壓調(diào)節(jié)中起著重要作用，同時(shí)也是高血壓損害的主要靶器官。小動(dòng)脈和微動(dòng)脈可通過血管舒縮調(diào)節(jié)血壓，血管舒縮的協(xié)調(diào)一直是維持血管功能的關(guān)鍵?？p隙連接（gap junctions，GJ）為相鄰兩個(gè)細(xì)胞間的特殊膜結(jié)構(gòu)，直接介導(dǎo)細(xì)胞間的電和化學(xué)信號交流，維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。近年來研究［2］顯示GJ與高血壓有密切聯(lián)系。前期研究［3－4］表明自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat，SHR）腦動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞連接蛋白45（connexin45，Cx45）表達(dá)均高于Wistar大鼠。該研究通過觀察應(yīng)用GJ阻斷劑18β-甘草次酸（18β-glycyrrhetintic acid，18β-GA）阻斷血管壁細(xì)胞間的GJ后SHR與Wistar大鼠腎葉間動(dòng)脈（arteriae interlobares renis，RIA）收縮活動(dòng)的異同，應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測Cx 45在SHR與Wistar大鼠RIA表達(dá)的差異，評估GJ功能在SHR和Wistar大鼠RIA收縮活動(dòng)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SHR大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，正常血壓Wistar大鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，約12周齡，雌雄不拘，體重約為250 g，清潔級。SHR作為實(shí)驗(yàn)組，Wistar大鼠作為對照組，每組各20只。

1.1.2 主要試劑與儀器 Cx45一抗（美國Abcam公司）；β-actin一抗、二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；BCA蛋白試劑盒（美國Pierce公司）；ECL發(fā)光試劑盒（美國Thermo公司）；苯腎上腺素（phenylephrine，PE）、18β-GA、乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）（美國Sigma公司）；氯化鉀（KCl）及其余試劑均為國產(chǎn)分析純。壓力型小動(dòng)脈測量儀（pressure myograph system，DMT，110P，丹麥），BP-6無創(chuàng)血壓監(jiān)測儀（四川成都泰盟公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠無創(chuàng)血壓測定 大鼠于40℃預(yù)熱適應(yīng)15 min后，清醒安靜狀態(tài)下用BP-6無創(chuàng)血壓監(jiān)測儀測量大鼠尾動(dòng)脈收縮壓，連續(xù)測量3次后取平均值。

1.2.2 大鼠RIA段的制備 將大鼠用1%戊巴比妥鈉2 ml／kg腹腔注射麻醉，斷頭放血處死動(dòng)物。迅速取出腎臟，置于4℃氧飽和（95%O2和5% CO2）生理鹽溶液（PSS）中?？v行剖開腎臟，固定于硅膠培養(yǎng)皿中，于解剖顯微鏡下，暴露葉間動(dòng)脈，清除血管周圍結(jié)締組織，選取無分支葉間動(dòng)脈。剪成2～3 mm的血管段用于壓力肌動(dòng)圖實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 壓力肌動(dòng)圖記錄血管直徑變化 將血管段置于裝有5 ml PSS液灌流槽內(nèi)，血管段一端套接在

口徑為50～100 μm玻璃插管（玻璃插管用P-97拉制儀拉制）上，用10-0眼科尼龍線加固以防漏氣，用裝有PSS液的注射器緩慢沖走管腔內(nèi)殘留血液，另一端套在另一個(gè)玻璃插管上同樣固定，灌流槽移至倒置顯微鏡臺上，放大倍數(shù)為100。血管段內(nèi)外均處于37℃氧飽和PSS中，浴槽中恒速通以95% O2、5%CO2混合氣體。用Myoview軟件（丹麥DMT公司）控制血管內(nèi)壓力并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。（DMT由一個(gè)攝像機(jī)和控制系統(tǒng)控制，血管直徑變化可通過視頻顯微測量技術(shù)和一個(gè)校準(zhǔn)視頻尺寸分析儀來記錄分析測量，單位是μm。）

血管段平衡后進(jìn)行標(biāo)化，先用K-PSS溶液（KCl 60 mmol／L）激發(fā)血管收縮，PSS沖洗后孵育30 min；給予PE（10－5mol／L）收縮血管，收縮達(dá)最大平臺后，用ACh（10－5mol／L）舒張血管，舒張率＞70%認(rèn)為內(nèi)皮完整，血管活性良好，可用于實(shí)驗(yàn)，否則丟棄，用PSS液沖洗后準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)。

血管穩(wěn)定30 min后開始實(shí)驗(yàn)。血管內(nèi)壓力7.98 kPa，溫度37℃，水浴槽內(nèi)PSS控制在5 ml，用微量移液器向浴槽中依次累積加入不同濃度KCl和PE終濃度分別為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mmol／L和0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30 μmol／L，血管達(dá)到最大反應(yīng)穩(wěn)定后加高一級濃度，分別觀察該濃度對血管直徑的影響，及加入18β-GA（100 μmol／L）干預(yù)后KCl和PE引起血管直徑的變化。觀察指標(biāo)：血管直徑，血管直徑變化D（μm）＝Dp－Dx；為了減小不同血管直徑的差異引起的誤差，采用血管收縮率比較所得結(jié)果，血管收縮率Rate（%）＝（Dp－Dx）／Dp。（Dp：血管段在PSS中穩(wěn)定時(shí)的直徑，Dx：藥物反應(yīng)后血管穩(wěn)定的直徑）

1.2.4 Western blot檢測 將動(dòng)脈放入預(yù)冷的RIPA緩沖液中，電動(dòng)勻漿器冰上充分勻漿，4℃離心機(jī)13 000 r／min離心15 min，取上清液后采用BCA法測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）：梯度膠（5%～10%）恒壓電泳，半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，5%脫脂奶粉的TBST中室溫封閉1 h，一抗（1∶1 000）4℃過夜，二抗（1∶20 000）中室溫孵育2 h，TBST清洗3次后與ECL反應(yīng)1 min，置于X線膠片暗盒中曝光、顯影。以目的蛋白和內(nèi)參β-actin的平均灰度值的比值作為蛋白相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 SHR和Wistar大鼠尾動(dòng)脈血壓SHR收縮壓（26.8±0.1）kPa高于Wistar大鼠收縮壓（15.7 ±0.1）kPa，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝20.52，P＜0.01）。

2.2 18β-GA抑制KCl對SHR和Wistar大鼠RIA血管的收縮作用10～100 mmol／L的KCl可引起SHR和Wistar大鼠RIA濃度依賴性的收縮，SHR的RIA收縮明顯高于Wistar大鼠，30～100 mmol／L KCl引起的收縮率不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），100 mmol／L KCl誘導(dǎo)的SHR和Wistar大鼠RIA的收縮率分別為（47.21±3.81）%和（41.27±4.76）%（P＜0.05）。18β-GA（100 μmol／L）預(yù)孵育20 min后，KCl誘導(dǎo)SHR和Wistar大鼠RIA的收縮率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），SHR比Wistar大鼠降低幅度更為明顯（P＜0.01）。見圖1。

圖1 KCl引起SHR和Wistar大鼠RIA血管收縮率曲線

2.3 18β-GA抑制PE對SHR和Wistar大鼠RIA血管的收縮作用在SHR和Wistar大鼠RIA血管上施加濃度為0.01～30 μmol／L的PE后，SHR和Wistar大鼠RIA可產(chǎn)生濃度依賴性的收縮反應(yīng)，PE引起SHR RIA收縮高于Wistar大鼠，0.3～30 μmol／L的PE引起的收縮率與Wistar大鼠存在差異（P＜0.05）。30 μmol／L PE作用于SHR和Wistar大鼠RIA，引起的收縮率分別為（51.7±4.77）%和

（43.0±4.65）%（P＜0.05）。經(jīng)18β-GA（100 μmol／L）孵育20 min后，PE引起SHR和Wistar大鼠RIA血管收縮率明顯降低，SHR下降更為顯著（P＜0.01）。見圖2。

圖2 血管收縮劑PE引起SHR和Wistar大鼠RIA收縮率曲線

2.4 SHR和Wistar大鼠RIA Cx45蛋白表達(dá)

SHR Cx45蛋白表達(dá)高于Wistar大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝－34.35，P＜0.05）。見圖3。

3 討論

血管壁內(nèi)皮細(xì)胞間、平滑肌細(xì)胞間，內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞間都存在著大量的GJ，血管壁才能夠在縱向上和橫向上的收縮與舒張反應(yīng)中保持電活動(dòng)、機(jī)械活動(dòng)的同步性，使得整個(gè)血管成為統(tǒng)一的功能單位，對興奮或非興奮信號作出一致反應(yīng)，維持血管生理活動(dòng)及功能穩(wěn)定性［5－7］。細(xì)胞間離子信號和其他調(diào)節(jié)信號可通過GJ迅速交換，如某一細(xì)胞受到刺激其離子電位發(fā)生變化并通過GJ迅速將離子或其他調(diào)節(jié)信號傳遞給相鄰細(xì)胞使之得到信號并迅速做出反應(yīng)。GJ在血管協(xié)調(diào)一致的舒縮活動(dòng)起到重要調(diào)節(jié)作用［8］。

高血壓是遺傳和環(huán)境因素共同作用引起的疾病，其發(fā)病機(jī)制除了遺傳和環(huán)境因素外，也與縮血管物質(zhì)分泌增多，活性增強(qiáng)；舒血管物質(zhì)分泌減少，活性減弱有關(guān)。有研究［2］顯示Cx在高血壓的發(fā)生發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵作用，參與了機(jī)體血壓的調(diào)節(jié)。

本實(shí)驗(yàn)顯示KCl和PE引起RIA的收縮作用與Wistar大鼠相比SHR明顯增強(qiáng)。Braunstein et al［9］研究發(fā)現(xiàn)SHR腎小球前小動(dòng)脈的收縮作用比血壓正常的大鼠強(qiáng)40%，本研究結(jié)果與之一致。由此推測SHR的RIA血管收縮作用的增強(qiáng)可能與SHR血管壁GJ的改變有關(guān)。運(yùn)用GJ阻斷劑18β-GA干預(yù)RIA血管壁細(xì)胞間GJ，結(jié)果顯示，18β-GA抑制了KCl和PE的收縮作用，且SHR抑制程度明顯高于Wistar大鼠，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)檢測RIA上Cx45的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SHR Cx45的表達(dá)明顯增高。前期研究［10］顯示在SHR及Wistar大鼠的腸系膜三級動(dòng)脈上施加KCl和PE誘導(dǎo)血管收縮，SHR的收縮反應(yīng)明顯增強(qiáng)，應(yīng)用GJ阻斷劑2-APB（100 μmol／L）后，血管收縮反應(yīng)均顯著減弱，其中SHR減弱幅度更加顯著，同時(shí)有研究［3］顯示SHR血管Cx45的表達(dá)明顯增多。Li et al［11］發(fā)現(xiàn)腦動(dòng)脈平滑肌Cx45的表達(dá)增高，本研究結(jié)果與之相似。由此推測SHR的RIA的平滑肌細(xì)胞Cx45的上調(diào)與其收縮作用的增強(qiáng)有關(guān)。

綜上所述，SHR的RIA血管對血管收縮劑的反應(yīng)性更強(qiáng)，可能與自發(fā)性高血壓引起RIA平滑肌Cx45蛋白表達(dá)增加，GJ通訊增強(qiáng)有關(guān)。Ca2＋是參與血管收縮的重要因子，KCl和PE收縮機(jī)制均為引起細(xì)胞質(zhì)鈣濃度的增加而產(chǎn)生血管收縮。SHR大鼠平滑肌細(xì)胞間的CJ通道增多，平滑肌細(xì)胞去極化后Ca2＋在血管壁平滑肌細(xì)胞間經(jīng)GJ的傳遞和擴(kuò)散加快，因此參與RIA協(xié)調(diào)性收縮活動(dòng)的平滑肌細(xì)胞數(shù)量增多，血管收縮作用增強(qiáng)。應(yīng)用GJ阻斷劑后，阻斷了GJ通道，Ca2＋血管壁平滑肌細(xì)胞間經(jīng)GJ的傳遞和擴(kuò)散減慢，其中參與RIA協(xié)調(diào)性收縮活動(dòng)的

平滑肌有效細(xì)胞數(shù)目減少，血管收縮活動(dòng)減弱。SHR RIA收縮作用的增強(qiáng)可能是由于Cx45的上調(diào)，GJ阻斷劑阻斷GJ后，SHR和Wistar大鼠RIA收所作用均減弱，SHR減弱幅度更大，這種減弱作用的差異可能與Cx45的表達(dá)變化有關(guān)。

將高血壓狀態(tài)下GJ的改變和高血壓引起的腎血管結(jié)構(gòu)和功能的改變相聯(lián)系，GJ阻斷劑或激活劑可以通過改善高血壓病引發(fā)的血管的不良重塑對血管舒縮活動(dòng)的影響，為今后臨床治療高血壓病繼發(fā)性腎臟脈管系統(tǒng)損害提供一定的理論依據(jù)。

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Effects of gap junction on renal interlobar artery contraction in spontaneously hypertensive rats

Zhang Wen1，Ma Ketao1，2，Liu Weidong1，et al
（1Dept of Physiology，Medical College of Shihezi University，Shihezi 832002，2Key Laboratory of Education Ministry of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases，Shihezi 832002）

ObjectivTo investigate the change of gap junction in renal interlobar of spontaneous hypertension rats（SHR）and its relationship with hypertension.MethodsPressure myograph was used to observe the influences of KCl and phenylephrine（PE）on the vascular contraction activities，and the differences after applying 18β-GA in RIA of SHR and Wistar rats.Western blot technique was used to investigate the differences in expressions of connexin 45（Cx45）on protein levels in renal interlobar artery between SHR（n＝20）and Wistar rats（n＝20）.Results①The contraction reaction was induced by KCl and PE in a concentration dependent manner，and the contraction reaction of SHR was stronger than Wistar rats.After applying of 18β-GA（100 μmol／L），KCl and PE caused the significantly lower contraction rate of RIA，and that was more significant in SHR.②The expression of Cx45 protein was significantly elevated in renal interlobar artery from SHR compared with normotensive Wistar rats（P＜0.05）.ConclusionThe enhancement of contraction of RIA in SHR maybe relate to the upregulation of Cx45 expression and increase gap junction communication in vascular smooth muscle cells of renal interlobar artery from SHR.

spontaneously hypertensive rats；gap junction；renal interlobar artery；connexin；pressure myograph system

R 331.3；R544.1

A

1000－1492（2014）11－1570－04

2014－06－19 接收

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（編號：2012CB526600）；國家自然科學(xué)基金（編號：31260247）

1新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室，石河子 832002

2新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832002

張 雯，女，碩士研究生；

李 麗，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：Lily7588＠163.com