脊髓水平TRPM8激活參與疼痛－瘙癢共病的研究

湯黎黎，陳家驊，魯顯福，，，劉 鶴

脊髓水平TRPM8激活參與疼痛－瘙癢共病的研究

湯黎黎1，陳家驊2，魯顯福1，2，3，劉 鶴3

目的觀察神經(jīng)病理性疼痛對瘙癢神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，探討瞬時(shí)受體電位M8離子通道（TRPM8）在瘙癢－疼痛共病中的作用。方法實(shí)驗(yàn)一：將KM雄性小鼠48只隨機(jī)分為6組，神經(jīng)病理性疼痛組（SNI）、假手術(shù)組（Sham）、瘙癢組（CQ）、瘙癢溶媒組（NS）、疼痛瘙癢共病組（SQ）及空白對照組（CON）；實(shí)驗(yàn)二：KM雄性小鼠16只，分為SQ＋AMTB（SQ-A）組和SQ＋AMTB溶媒對照組（SQ-V）。CON、SNI、Sham、SQ組在術(shù)前1 d，術(shù)后1、3、5 d測定術(shù)側(cè)機(jī)械痛閾值（MWT）、冷痛閾值及熱痛潛伏期（PWL），CON、CQ、NS、SQ組分別注射氯喹或生理鹽水后觀察搔抓發(fā)作潛伏期及發(fā)作次數(shù)；實(shí)驗(yàn)二：SNI模型建立第5天分別鞘注AMTB（SQ-A）及溶媒（SQ-V）前后測定疼痛行為學(xué)，注射氯喹和生理鹽水后觀察瘙癢行為學(xué)。結(jié)果SNI組及SQ組在術(shù)后1 d冷痛閾值及MWT降低，第5天仍在較低水平，而PWL僅在術(shù)后1 d下降差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。SQ-A組較SQ-V組鞘注后冷痛閾值、MWT顯著升高（P＜0.05），兩組PWL變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CQ組較NS組定向搔抓次數(shù)顯著增多，搔抓潛伏期縮短（P＜0.05），SQ組搔抓次數(shù)明顯低于CQ組（P＜0.05），但搔抓潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。SQ-A組搔抓次數(shù)顯著高于SQ-V組（P＜0.05），但搔抓潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論疼痛－瘙癢共病時(shí)疼痛能夠抑制瘙癢神經(jīng)信號傳導(dǎo)，可能與神經(jīng)病理性疼痛引起的TRPM8受體表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

神經(jīng)病理性痛；瘙癢；TRPM陽離子通道；氯喹

臨床上，帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛、尿毒癥等慢性疼痛性疾病常以疼痛－瘙癢共病的癥狀同時(shí)出現(xiàn)，卻缺乏特異性有效治療藥物［1］。疼痛和瘙癢是兩種不同的感覺體驗(yàn)，二者之間可能存在復(fù)雜的交互作用。瞬時(shí)受體電位M8離子通道（transient receptor potential melastatin 8，TRPM8）是機(jī)體溫度敏感性瞬時(shí)感受器電位（transient receptor potential，TRP）蛋白超家族中一員，主要分布在外周三叉神經(jīng)節(jié)和脊髓背根神經(jīng)節(jié)的初級傳入神經(jīng)元，主要介導(dǎo)機(jī)體冷痛覺［2］，可被薄荷醇、冷刺激（＜28℃）等激活，是否參與了瘙癢癥狀的形成與發(fā)展，目前尚未明確。該研究擬對疼痛與瘙癢之間的相互關(guān)系進(jìn)行研究，并探討TRPM8活性是否參與疼痛－瘙癢共病。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與主要材料SPF級KM小鼠，雄性，64只，體重20～30 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。冷板足底觸覺測量器、YLS-智能熱板儀及機(jī)械痛測痛架（安徽淮北正華實(shí)驗(yàn)器材有限公司）；電子Von-frey機(jī)械測痛儀（美國IITC Life Science）；氯喹（批號：101197043，美國Sigma公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 坐骨神經(jīng)選擇性分支損失疼痛模型的建立參照文獻(xiàn)［3］，小鼠左側(cè)后肢切開皮膚，分離皮下及肌肉，暴露并分離坐骨神經(jīng)及其3末端分支：腓腸神經(jīng)、腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)，用6-0絲線結(jié)扎腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)，靠近結(jié)扎處切斷，保留大約2 mm的遠(yuǎn)側(cè)殘端，保持腓腸神經(jīng)完整，縫合肌肉和皮膚。

1.2.2 瘙癢模型 參照文獻(xiàn)［4］，左手戴手套固定小鼠，實(shí)驗(yàn)前1 d小鼠頸背部皮膚用脫毛劑脫毛，次日小鼠適應(yīng)環(huán)境后在頸部脫毛處皮下注射200 μg／50 μl氯喹誘導(dǎo)瘙癢模型。

1.2.3 鞘內(nèi)注射 拇指和中指固定小鼠腰5橫凸，將皮膚捏緊，消毒，用微量注射器在L4／5椎間隙進(jìn)針，直接注射，出現(xiàn)小鼠側(cè)向甩尾，表明藥物進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，回抽無血即注射工具藥。

1.3 動物行為學(xué)測定

1.3.1 冷痛閾值測定 參照文獻(xiàn)［5］方法，將小鼠放在表面溫度為（4±1）℃的冷板上，外罩透明塑料籠子，適應(yīng)環(huán)境5 min，其探究活動基本消失后，開始記錄隨后20 min內(nèi)術(shù)側(cè)后肢的抬足次數(shù)及累計(jì)抬足時(shí)間，小鼠因活動或體位變化所引起的抬足不計(jì)入內(nèi)。

1.3.2 熱痛閾值測定 采用58℃的熱板進(jìn)行熱痛

縮爪潛伏期（paw withdrawal latency，PWL）測定［6］。動物先在室溫20～23℃的實(shí)驗(yàn)環(huán)境內(nèi)適應(yīng)（至少30 min）后，采用智能熱板儀測定小鼠術(shù)側(cè)PWL，每間隔4 min測定1次，計(jì)3次平均值作為最終測定結(jié)果；最大熱痛潛伏期設(shè)定為15 s。

1.3.3 機(jī)械痛閾值測定 采用電子Election Vonfrey測定機(jī)械閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）。小鼠置于透明有機(jī)玻璃箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境30 min，將Election Vonfrey Rigid tip垂直安放在傳感器上，空載調(diào)零后，觀察最大折力數(shù)據(jù)，間隔5 min測1次，共測3次，取平均值作為MWT測定結(jié)果。

1.3.4 瘙癢行為反應(yīng)觀察 該研究采用氯喹誘導(dǎo)的非組胺依賴性瘙癢模型。小鼠在玻璃罩內(nèi)適應(yīng)環(huán)境后，氯喹皮下注射，注射結(jié)束到第一次定向頸部脫毛處搔抓時(shí)間記為搔抓潛伏期，后足定向向注射部位連續(xù)騷抓的動作定義為搔抓發(fā)作，30 min的觀察期內(nèi)每5 min的時(shí)間間隔記錄搔癢發(fā)作的數(shù)目［4］。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)一：雄性KM小鼠48只隨機(jī)分為6組，分別為坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷組（SNI）、假手術(shù)組（Sham）、瘙癢組（CQ）、瘙癢對照組（NS）、空白對照組（CON）及疼痛－瘙癢共病組（SQ）。SNI組為選擇性切斷腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)組；Sham組只分離神經(jīng)不進(jìn)行結(jié)扎切斷；CQ組于小鼠頸背部注射200 μg／50 μl氯喹；NS組于小鼠頸背部注射50 μl的生理鹽水；SQ組是小鼠進(jìn)行SNI疼痛模型后第5天于頸背部注射200 μg／50 μl氯喹；CON組不進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)二：健康雄性KM小鼠16只隨機(jī)分為2組，分別是疼痛瘙癢共病模型加TRPM8拮抗劑（AMTB）組（SQ-A）和疼痛瘙癢共病模型加AMTB溶媒組（SQ-V）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Graphpad_Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用雙因素方差分析或t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組疼痛行為學(xué)的變化SNI組較Sham組及CON組術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)機(jī)械痛閾值、冷板抬足時(shí)間、抬足次數(shù)行為學(xué)指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），術(shù)后SNI組熱痛閾值較術(shù)前下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但是各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Sham組在術(shù)后1 d機(jī)械痛閾值MWT較術(shù)前1 d下降（P＜0.05），其他時(shí)點(diǎn)及熱痛閾值及冷痛閾值行為學(xué)指標(biāo)較術(shù)前差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Sham組和CON組在同一時(shí)點(diǎn)行為學(xué)指標(biāo)差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 瘙癢行為學(xué)變化CQ組較NS組瘙癢發(fā)作潛伏期明顯縮短（133.70±7.94 vs 303.80±42.48，P＜0.05），前20 min的每5 min觀察周期內(nèi)，搔抓次數(shù)顯著多于NS組及CON組（P＜0.01），后10 min搔抓次數(shù)較前有所下降但仍高于NS組（P＜0.05）。NS組在30 min搔抓總次數(shù)及5 min小周期內(nèi)搔抓次數(shù)較CON組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組搔抓次數(shù)比較（次，n＝8，±s）

表1 各組小鼠疼痛行為學(xué)不同時(shí)點(diǎn)的比較（n＝8，±s）

表1 各組小鼠疼痛行為學(xué)不同時(shí)點(diǎn)的比較（n＝8，±s）

與同組術(shù)前1 d比較：▲P＜0.05；與同時(shí)點(diǎn)CON組比較：ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與同時(shí)點(diǎn)Sham組比較：**P＜0.01

項(xiàng)目組別術(shù)前1 d術(shù)后1 d術(shù)后3 d術(shù)后5 d MWT（g）SNI11.17±0.211.26±0.22ΔΔ**1.20±0.15ΔΔ**0.91±0.22ΔΔ**Sham11.86±0.3110.65±0.15Δ11.73±0.3611.89±0.12 CON11.93±0.1011.69±0.1511.97±0.1912.02±0.45 PWL（s）SNI8.30±0.207.46±0.33▲7.96±0.367.21±0.19 Sham8.56±0.588.47±0.398.60±0.187.85±0.58 CON8.28±0.478.47±0.508.13±0.518.10±0.60抬足次數(shù)（次）SNI8.67±1.2627.33±2.49ΔΔ29.33±3.70ΔΔ25.00±4.24ΔΔSham9.17±2.218.50±1.738.67±2.068.67±2.19 CON8.17±1.018.33±1.388.17±1.478.67±1.71抬足時(shí)間（s）SNI8.61±1.0628.98±3.47ΔΔ**31.13±4.07ΔΔ**25.73±3.44ΔΔ**Sham9.00±2.3910.25±2.128.82±3.128.78±3.21 CON8.88±1.918.95±1.789.42±2.919.05±2.03

表2 SQ-A組和SQ-V組術(shù)前1 d、術(shù)后1 d、術(shù)后5 d腰段鞘注AMTB及溶媒前后疼痛行為學(xué)的變化（n＝8，±s）

表2 SQ-A組和SQ-V組術(shù)前1 d、術(shù)后1 d、術(shù)后5 d腰段鞘注AMTB及溶媒前后疼痛行為學(xué)的變化（n＝8，±s）

與同組術(shù)前1 d比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與同組鞘注前比較：▲▲P＜0.01；與鞘注后SQ-V組比較：ΔP＜0.05

觀察項(xiàng)目組別術(shù)前1 d術(shù)后1 d 鞘注前鞘注后機(jī)械痛閾值（g）SQ-A11.79±0.321.21±0.23**1.20±0.116.34±0.41Δ▲▲SQ-V10.94±0.341.22±0.08**1.21±0.281.11±0.15熱痛閾值（S）SQ-A8.79±0.716.87±0.48*7.23±0.717.33±0.37 SQ-V8.08±0.506.59±0.36*7.76±0.377.69±0.25冷板抬足次數(shù)（次）SQ-A8.50±1.8225.00±4.20**25.83±1.228.50±1.78Δ▲▲SQ-V8.33±1.0221.67±1.26**22.83±1.0119.33±1.99冷板抬足時(shí)間（s）SQ-A8.07±1.9128.35±5.83**29.80±1.878.13±1.69Δ▲▲SQ-V7.42±0.9423.27±1.28**24.38±2.5320.13±2.35

2.3 SQ組鞘注TRPM8阻斷劑AMTB及溶媒后行為學(xué)變化

2.3.1 疼痛行為學(xué) SNI模型術(shù)后1 d及術(shù)后5 d較術(shù)前MWT、冷板抬足時(shí)間、抬足次數(shù)行為學(xué)指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），PWL較術(shù)前顯著下降（P＜0.05），第5天腰段鞘注5 μl AMTB 30 μg／kg后各行為學(xué)指標(biāo)較鞘注前差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而SQ-V組鞘注溶媒后較鞘注前無明顯變化（P＞0.05），在術(shù)后5 d分別鞘注前后觀察，SQ-A組與SQ-V組疼痛行為學(xué)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而鞘注后SQ-A組較SQ-V組MWT、PWL及冷板抬足次數(shù)、冷板抬足時(shí)間變化差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

2.3.2 瘙癢行為學(xué) 本實(shí)驗(yàn)中SNI模型術(shù)后鞘注AMTB劑量為30 μg／kg，30 min后，頸背部皮下注射氯喹，30 min瘙癢發(fā)作次數(shù)比鞘注前及溶媒組顯著增多（P＜0.05），但發(fā)作潛伏期較鞘注前及溶媒組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 小鼠的搔抓次數(shù)變化（次，n＝8，±s）

3 討論

本研究制備SNI神經(jīng)病理性疼痛模型，術(shù)后24 h即可觀察到MWT明顯降低和冷板抬足次數(shù)及抬足累計(jì)時(shí)間顯著增多，隨時(shí)間進(jìn)展持續(xù)較低水平，是一種對機(jī)械刺激更為敏感、穩(wěn)定性也更高的神經(jīng)病理性疼痛模型［7］。但國內(nèi)既往研究［8］及本研究顯示：在較短的周期內(nèi)，SNI模型對熱刺激敏感性稍差，術(shù)后1 d，各組間熱痛敏化反應(yīng)不明顯，可能與觀察周期較短有關(guān)，與文獻(xiàn)［3］結(jié)果一致。TRPM8選擇性阻斷劑鞘內(nèi)注射后機(jī)械痛閾值及冷痛閾值較鞘注前有顯著的行為學(xué)變化，表明TRPM8通道參與了神經(jīng)病理性疼痛中冷痛覺敏化的發(fā)生和維持。有學(xué)者在CCI神經(jīng)病理性疼痛模型觀察到該模型中TPRM8增多的趨勢與冷異常性疼痛的發(fā)展過程一致［9－10］。

本研究觀察到CQ組的搔抓發(fā)作潛伏期較NS組明顯縮短，30 min總搔抓次數(shù)顯著增多也驗(yàn)證了MrgprA3＋初級傳入神經(jīng)纖維興奮后在脊髓背角與特異性介導(dǎo)瘙癢反應(yīng)的GRPR＋神經(jīng)元形成直接的突觸聯(lián)系［11］。在疼痛瘙癢共病模型中，觀察到神經(jīng)病理性疼痛形成后，30 min觀察周期內(nèi)搔抓次數(shù)較單純瘙癢組明顯下降，因此可推測神經(jīng)病理性疼痛與瘙癢在脊髓背角或以上的中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能存在神經(jīng)突觸聯(lián)系，抑制瘙癢的信號傳導(dǎo)，減少其行為學(xué)的發(fā)作次數(shù)。疼痛瘙癢共病模型鞘注AMTB 30 μg／kg后，這種抑制作用減弱，SQ-A組小鼠搔抓發(fā)作次數(shù)較鞘注SQ-V組顯著增多，該變化的神經(jīng)機(jī)制尚不清楚，神經(jīng)病理性疼痛時(shí)TRPM8的表達(dá)上調(diào)可能參與其中。

本研究僅通過瘙癢－疼痛模型的行為學(xué)變化，初步考察了冷感覺通道TRPM8在疼痛抑制瘙癢現(xiàn)象中的作用，但TRPM8阻斷劑鞘注后易化瘙癢癥狀的發(fā)作，其參與疼痛－瘙癢的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，可能仍有潛在的引起皮膚瘙癢的副作用，因此，TRPM8可能并不是探索新型鎮(zhèn)痛藥物的理想靶點(diǎn)。

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Activation of spinal TRPM8 signaling pathway contributes to the co-morbidity of itch and pain

Tang Lili1，Chen Jiahua2，Lu Xianfu1，2，3，et al
（1Dept of Anesthesiology，2Dept of Pain Management，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；3Jiangsu Provincial Key Laboratory of Anesthesiology，Xuzhou 221000）

ObjectivTo evaluate the roles for the co-morbidity of itch and pain，and to investigate the effect of TRPM8 in these processes.MethodsIn test 1，F(xiàn)orty-eight male KM mice were randomly divided into the CON group，Sham group，SNI group，CQ group，NS group and SQ group.The threshold of cold hyperalgesia，heat hyperalgesia and mechanical hyperalgesia were measured before operation and at 1，3 and 5 d after operation in CON，SNI，Sham and SQ group.The scratching numbers were calculated within 30 minutes after chloroquine or saline injection in CON，CQ，NS and SQ group.In test 2，sixteen male KM mice were randomly divided into SQ-A and SQV group after 5 d of SNI operation，whose threshold of cold hyperalgesia，heat hyperalgesia and mechanical hyperalgesia were measured，respectively.Mice underwent lumbar intrathecal injection of TRPM8 specific blocker AMTB 30 μg／kg in SQ-A group，while the SQ-V group received TRPM8 specific blocker AMTB vehicle.The scratching numbers were observed within 30 minutes of two groups’hair removal after chloroquine injection.ResultsCompared with Sham group and CON group，the total number and time of brisk lifts of operated hind paw in SNI group and SQ group were significantly increased on 1 d after SNI，and reached the peak on 3 d；MWT following SNI was significantly lower on 1 d and reached the peak on 5d；PWL was significantly reduced only on 1d postoperation（P＜0.05）.Compared with SQ-V group，SQ-A group had significantly higher cold threshold and higher MWT（P＜0.05）.However，there were no significant differences in PWL between the two groups.The directional scratching number of CQ group was significantly increased than the NS group and CON group，and the scratching latency was shorter（P＜0.05）.The scratching number in the SQ group was significantly lower than that of CQ group（P＜0.05）.The directional scratching number in the SQ-A group was significantly increased than that of the SQ-V group（P＜0.05）.There were no significant differences in the scratching latency.ConclusionNeuropathic pain suppress the transmission of pruritic information in the spinal dorsal horn，which the mechanism may be related to the upregulation of TRPM8 protein expression after neuropathic pain.

neuropathic pain；itch；TRPM cation channels；chloroquine

R 441.1

A

1000－1492（2014）11－1562－04

2014－06－27 接收

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（編號：81300957）；江蘇省教育廳高校省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（編號：KJS1101）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1麻醉科、2疼痛科，合肥230022

3江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，徐州 221000

湯黎黎，女，住院醫(yī)師，碩士研究生；

陳家驊，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：chenjiahua001＠sina.com