間充質(zhì)干細(xì)胞在哮喘大鼠氣道炎癥及氣道重塑中的作用

李 潔，莫碧文，毛雨紅，李勞東，王志霞，牛坤汀，王昌明，曾錦榮，韋江紅，黃劍偉

間充質(zhì)干細(xì)胞在哮喘大鼠氣道炎癥及氣道重塑中的作用

李 潔1，莫碧文1，毛雨紅2，李勞東3，王志霞1，牛坤汀1，王昌明1，曾錦榮1，韋江紅1，黃劍偉1

目的探討間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）在哮喘大鼠慢性氣道炎癥及氣道重塑中的作用。方法將18只SD雌性大鼠隨機(jī)分為：正常對照組、哮喘4周組和哮喘8周組，每組6只。卵清蛋白（OVA）致敏后，霧化吸入OVA制作哮喘模型。哮喘模型成功后，測定氣道壓力；通過HE染色、Image-Pro Plus圖像分析軟件分析大鼠氣道平滑肌的嗜酸性粒細(xì)胞（ESO）浸潤情況，測定支氣管管腔的內(nèi)周長、管壁面積，支氣管平滑肌面積、平滑肌細(xì)胞核數(shù)；采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測各組MSCs的含量，并分析其與哮喘氣道炎癥及氣道重塑的關(guān)系。結(jié)果哮喘4周組、哮喘8周組大鼠的氣道反應(yīng)性、氣道壁EOS計(jì)數(shù)、支氣管管壁面積、支氣管平滑肌面積、平滑肌細(xì)胞核數(shù)目、外周血中MSCs比例均較正常對照組顯著增加（P＜0.01，P＜0.05）；哮喘兩組間上述指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Pearson線性相關(guān)顯示：各組大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞中MSCs的含量與氣道反應(yīng)性、EOS浸潤數(shù)、支氣管壁面積、支氣管平滑肌厚度及支氣管平滑肌細(xì)胞核數(shù)均呈正相關(guān)（P＜0.01）。結(jié)論MSCs在哮喘狀態(tài)下含量增加，可能參與了哮喘的慢性氣道炎癥及氣道重塑。

間充質(zhì)干細(xì)胞；支氣管哮喘；氣道炎癥；氣道重塑

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是全球性的嚴(yán)重威脅人類健康的重要疾病之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有多向分化功能的非造血干細(xì)胞，已有研究［1－2］顯示MSCs可能在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起著較為重要的作用。目前國內(nèi)外關(guān)于MSCs在哮喘中的研究，大多局限于其治療作用，而關(guān)于其是否參與哮喘致病過程的研究甚少。因此，該研究將建立哮喘模型，檢測慢性哮喘大鼠和正常大鼠外周血中MSCs含量，觀察其含量與哮喘氣道炎癥和氣道重塑的關(guān)系，初步探討MSCs與哮喘致病過程之間是否可能存在聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物SPF級雌性SD大鼠18只，6～8周齡，200～250 g，由桂林醫(yī)學(xué)院SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 主要試劑及儀器氫氧化鋁凝膠、卵清白蛋白（OVA）、多聚甲醛均購自美國Sigma公司；滅活百日咳桿菌購自北京生物研究所；402AI型超聲霧化器購自魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司；Percoll分離液購自美國GE公司；小鼠抗大鼠FITC-CD44、PE-CD45及同型對照抗體均購自美國Biolegend公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物分組 SD大鼠隨機(jī)均分成3組。正常對照組：霧化吸入磷酸鹽緩沖液（PBS），每日1次，共8周；哮喘4周組：每日霧化吸入2%OVA激發(fā)哮喘1次，共4周；哮喘8周組：每日霧化吸入2% OVA激發(fā)哮喘1次，共8周。

1.3.2 哮喘模型建立 每只大鼠于第1、8天皮下注射10 mg OVA和200 mg氫氧化鋁凝膠，同時(shí)腹腔注射5×109個(gè)滅活百日咳桿菌。于第15天將大鼠置于密閉玻璃容器內(nèi)，予2%OVA·PBS 50 ml霧化吸入30 min激發(fā)哮喘，以大鼠出現(xiàn)煩躁、咳嗽、呼吸困難等哮喘發(fā)作的典型表現(xiàn)為激發(fā)成功；正常對照組則以PBS代替致敏原致敏并霧化吸入。

1.3.3 氣道壓力測定 各組哮喘大鼠模型建立成功后，予10%水合氯醛麻醉，氣管切開插管，連接動物呼吸機(jī)，潮氣量10 ml／kg，頻率60次／min，氣管插管的側(cè)孔連接呼吸機(jī)測壓管道，直接測得氣道壓力數(shù)值。用PBS將鹽酸組胺配成濃度為1.28 g／L的混合液，然后稀釋至0.01 g／L。首先向氣管插管內(nèi)霧化噴入PBS，記錄氣管內(nèi)壓（airway pressure，Paw），然后從低濃度開始，噴入含鹽酸組胺的磷酸鹽緩沖液，1 min后開始測壓。若Paw升高未達(dá)到PBS對照的20%，則間隔10 min再噴入下一濃度，直至Paw升高20%為止。此時(shí)，所需霧化吸入的組

胺濃度以PC20表示。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本制作 上述各組大鼠測完氣道壓力后，左心室采血，并反復(fù)混勻抗凝，用于密度梯度離心分離外周血單個(gè)核細(xì)胞；迅速剝離肺組織，向肺內(nèi)注入適量4%多聚甲醛灌注固定，置4%多聚甲醛中保存，石蠟包埋切片作常規(guī)HE染色，光鏡下觀察各組氣道炎癥及氣道壁結(jié)構(gòu)。

1.3.5 氣道重塑情況 取3～4級完整支氣管，通過圖像分析軟件測定支氣管管腔的內(nèi)周長（perimeter inner，Pi）、管壁面積（wall area，W）、支氣管平滑肌面積（smooth muscle area，S）、平滑肌細(xì)胞核數(shù)（number of smooth muscle cells，N），將測得的值用管腔的Pi進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，分別以W／Pi、S／Pi、N／Pi表示。

1.3.6 流式細(xì)胞儀檢測MSCs的含量 將動物左心室采取的血液與PBS以1∶1的比例充分混勻，用滴管沿離心管壁緩慢滴加于等量Percoll分離液液面上，水平離心1 500 r／min，30 min。離心后管內(nèi)分三層，上層與中層之間有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的呈云霧狀的狹窄層。小心吸取單個(gè)核細(xì)胞至另一離心管中，加入適量PBS，1 500 r／min離心5 min，洗滌細(xì)胞沉淀3次。收集細(xì)胞后，用800 μl預(yù)冷PBS重懸，充分吹打混勻后，以每管100 μl分裝，依據(jù)抗體說明書向各管加入適量FITC-CD44、PE-CD45，且每管設(shè)立同型對照。避光4℃孵育30 min，1 500 r／min離心5 min，棄上清液，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞沉淀2次，各管取400 μl PBS重懸細(xì)胞，濾網(wǎng)過濾后上流式細(xì)胞儀檢測并分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，MSCs的含量與各指標(biāo)間的關(guān)系采用Pearson線性相關(guān)分析，以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠氣道反應(yīng)性的比較哮喘4周組與哮喘8周組的PC20值均較正常對照組顯著降低（P＜0.01），且哮喘8周組的氣道反應(yīng)性較哮喘4周組顯著增高（F＝158.75，P＜0.01），見表1。

表1 各組大鼠氣道反應(yīng)性EOS浸潤情況比較（n＝6，±s）

表1 各組大鼠氣道反應(yīng)性EOS浸潤情況比較（n＝6，±s）

與正常對照組比較：**P＜0.01；與哮喘4周組比較：＃＃P＜0.01

組別PC20值（mg／ml）EOS數(shù)（N／HP）正常對照0.37±0.044.43±0.76哮喘4周0.13±0.04**60.32±0.55**哮喘8周0.03±0.06**＃＃72.64±0.54**＃＃

2.2 HE染色及嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophils，EOS）浸潤情況正常對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，無明顯炎癥反應(yīng)，病理變化不明顯；哮喘組大鼠的肺組織HE染色可見肺泡腔、肺泡間隔、支氣管及血管周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管腔內(nèi)有不同程度的滲出，支氣管平滑肌層增厚，纖毛上皮細(xì)胞脫落，基底膜增厚，黏膜腫脹充血形成皺襞，見圖1。哮喘4周組和8周組大鼠氣道壁浸潤的EOS數(shù)目較正常對照組顯著增多（P＜0.01），且哮喘8周組亦較4周組顯著增多（F＝20 169.61，P＜0.01），見表1。

圖1 大鼠肺組織病理切片HE×200

2.3 支氣管管壁面積、支氣管平滑肌厚度及支氣管平滑肌細(xì)胞核數(shù)目的比較哮喘組大鼠HE染色肺組織標(biāo)準(zhǔn)化后的W／Pi、S／Pi、N／Pi均較正常對照組顯著增加（P＜0.01）；與哮喘4周組相比，哮喘8周組大鼠的W／Pi、S／Pi、N／Pi均顯著增加（F＝426.47、648.80、133.98，P＜0.01），見表2。

表2 各組大鼠W／Pi、S／Pi及N／Pi的比較（n＝6，±s）

表2 各組大鼠W／Pi、S／Pi及N／Pi的比較（n＝6，±s）

與正常對照組比較：**P＜0.01；與哮喘4周組比較：＃＃P＜0.01

組別W／Pi（μm2／μm）S／Pi（μm2／μm）N／Pi（n／μm）正常對照5.96±0.372.89±0.230.012±0.001哮喘4周9.94±0.30**6.00±0.15**0.019±0.002**哮喘8周11.17±0.30**＃＃8.34±0.36**＃＃0.029±0.002**＃＃

2.4 流式細(xì)胞儀檢測各組大鼠MSCs含量的差異

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：哮喘4周組［（3.35± 0.59）%］與8周組［（5.60±0.42）%］大鼠外周血中MSCs的含量顯著高于正常對照組［（2.26± 0.81）%］（P＜0.05，P＜0.01），哮喘8周組亦顯著高于哮喘4周組（F＝52.17，P＜0.01），見圖2。

圖2 各組大鼠外周血中CD44（＋）、CD45（－）雙標(biāo)記MSCs在流式細(xì)胞儀上的散點(diǎn)圖

2.5 各組大鼠外周血中MSCs含量與哮喘氣道炎癥及氣道重塑的相關(guān)性Pearson線性相關(guān)分析顯示：各組大鼠外周血中MSCs含量與PC20呈負(fù)相關(guān)；而其含量與EOS浸潤數(shù)、支氣管壁面積、支氣管平滑肌厚度及支氣管平滑肌細(xì)胞核數(shù)呈正相關(guān)（r值分別為－0.833、0.819、0.849、0.903、0.873，均P＜0.01）。

3 討論

MSCs是來源于中胚層的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，這類細(xì)胞在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境和影響因子的作用下可以向肺、骨、脂肪、肌肉等多種組織細(xì)胞分化［3］。研究［4］顯示，MSCs高表達(dá)CD44，低表達(dá)CD45，本實(shí)驗(yàn)采用密度梯度離心法分離獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測哮喘大鼠模型外周血中CD44（＋）CD45（－）MSCs的含量，探討MSCs與哮喘致病過程之間的關(guān)系。結(jié)果證實(shí)：哮喘4周組和8周組大鼠的外周血中MSCs的含量顯著高于正常對照組，且隨著哮喘狀態(tài)的延長，哮喘大鼠外周血中MSCs的含量逐漸增加，推測MSCs可能參與哮喘的發(fā)生發(fā)展。

支氣管哮喘是一種常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其基本病理特征包括：氣道炎癥和氣道重塑［5－6］。氣道炎癥主要表現(xiàn)為支氣管黏膜下、支氣管周圍及肺泡腔大量炎癥細(xì)胞浸潤。炎性細(xì)胞可通過合成和釋放多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)誘發(fā)支氣管哮喘的發(fā)作，其在哮喘發(fā)病過程中起著重要作用。本研究病理結(jié)果顯示：哮喘大鼠可見肺泡腔、支氣管及血管周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤，伴有不同程度的滲出，纖毛上皮細(xì)胞脫落，黏膜腫脹充血，且氣道壁浸潤的EOS數(shù)目較正常對照組顯著增多，與文獻(xiàn)［7］報(bào)道一致。此外，本實(shí)驗(yàn)還顯示各組大鼠外周血中MSCs含量與氣道壁EOS浸潤情況呈正相關(guān)，提示MSCs可能參與了哮喘慢性氣道炎癥。研究［8－9］表明，MSCs在一定條件下可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞等，具有高度分化能力。由此，推測MSCs參與哮喘慢性氣道炎癥的機(jī)制可能是哮喘病理狀態(tài)下產(chǎn)生的大量細(xì)胞因子通過不同的方式誘導(dǎo)MSCs分化為EOS、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞，趨化遷移至氣道壁及其周圍，從而促進(jìn)氣道炎癥反應(yīng)。

氣道重塑是支氣管哮喘的核心病理改變之一，即便是輕度的哮喘患者也存在哮喘氣道重塑的現(xiàn)象。哮喘氣道重塑是導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性的重要病理基礎(chǔ)，主要以上皮下纖維化、氣道平滑肌細(xì)胞增殖、黏液腺及杯狀細(xì)胞增生為主要特征［10－11］。Saunders et al［12］發(fā)現(xiàn)MSCs來源的成纖維細(xì)胞遷移至氣道壁，從而使哮喘氣道中肌成纖維細(xì)胞增多。近期研究［13－14］也提示，除了細(xì)胞分裂增加、凋亡減少外，氣道平滑肌細(xì)胞的增殖可能與MSCs遷移至平滑肌束的細(xì)胞數(shù)目增加有關(guān)。本研究顯示：哮喘4周組和8周組大鼠氣道反應(yīng)性與W／Pi、S／Pi、N／Pi均顯著高于正常對照組，且隨著與抗原接觸時(shí)間的延長，氣道重塑程度逐漸加重，與既往研究［10］結(jié)果相符。此外，各組大鼠外周血中MSCs含量與哮喘氣道重塑臨床病理指標(biāo)的關(guān)系顯示：各組大鼠外周血中MSCs含量與PC20值呈負(fù)相關(guān)，與W／Pi、S／Pi、N／Pi呈正相關(guān)，提示MSCs與哮喘氣道重塑密切相關(guān)，可能通過趨化遷移至氣道壁并分化為成纖維細(xì)胞或氣道平滑肌細(xì)胞參與哮喘氣道重塑，但其具體機(jī)制尚不清楚。

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The role of mesenchymal stem cells on airway inflammation and airway remodeling in asthma

Li Jie1，Mo Biwen1，Mao Yuhong2，et al
（1Dept of Respiratory Medicine，The Affiliated Hospital of Guilin Medical College，Guilin 541001；
2Dept of Respiratory Medicine，The First People′s Hospital of Hengyang，Hengyang 421001）

ObjectivTo explore the effect of mesenchymal stem cells on chronic airway inflammation and airway remodeling in a rat asthma model.MethodsEighteen SD female rats were randomly divided into 3 groups（n＝6）：control group，asthmatic 4 weeks group and asthmatic 8 weeks group.The rats were sensitized and inhaled with ovalbumin（OVA）to make asthmatic model.After successfully establishing model of asthma，the airway pressure had to be measured.The methods of HE staining and Image-Pro Plus image analysis software were used to detect the changes of eosinophils granulocytes（EOS），the perimeter inner of the bronchial lumen，the wall area，the area of bronchial smooth muscle and the number of smooth muscle cells.Density gradient centrifugation was used to isolate mesenchymal stem cells in peripheral blood，while the content of mesenchymal stem cells could be detected by the flow cytometry.The Role of mesenchymal stem cells on airway inflammation and airway remodeling in asthma was able to be analyzed from the above data.ResultsThe airway responsiveness，the count of EOS，the area of bronchial wall，the area of bronchial smooth muscle，the number of smooth muscle cells and the proportion of mesenchymal stem cells in the peripheral blood in the asthmatic 4 weeks group and asthmatic 8 weeks group was significantly higher than those in the control group（P＜0.01，P＜0.05）.Significant difference between two asthmatic groups was observed in the above indexes（P＜0.01）.Pearson linear correlation demonstrated that the content of mesenchymal stem cells was significantly positively correlated with the airway responsiveness，the number of EOS，the area of bronchial wall，the area of bronchial smooth muscle and the number of bronchial smooth muscle cells（P＜0.01）.ConclusionThe mesenchymal stem cells increase in the state of asthma，which may be involved in chronic airway inflammation and airway remodeling of asthma.

mesenchymal stem cells；bronchial asthma；airway inflammation；airway remodeling

R 562.2；R 322.34；R 322.35

A

1000－1492（2014）11－1549－04

2014－05－19 接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81260009）；廣西自然科學(xué)基金重點(diǎn)課題（編號：2012GXNSFDA053020）

1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，桂林 541001

2衡陽市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，衡陽 421001

3柳州市工人醫(yī)院呼吸內(nèi)科，柳州 545005

李 潔，女，碩士研究生；

莫碧文，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：mobiwen2002＠sohu.com