基于中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探析中醫(yī)治療肺炎的組方配伍規(guī)律及作用機(jī)制*

楊皓博，周銘晗，范文濤

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046）

肺炎（pneumonia）是指終末氣道、肺泡和肺間質(zhì)的炎癥，可由病原微生物、免疫損傷及藥物等因素所致。其中細(xì)菌性肺炎和病毒性肺炎占了多數(shù)，肺炎患者通常表現(xiàn)為肺部濕啰音，呼吸急促，嚴(yán)重者可出現(xiàn)持續(xù)性高熱、心悸、急性呼吸窘迫綜合征[1]。中醫(yī)學(xué)無“肺炎”病名，按照咳嗽、喘證辨證論治，常見證型有風(fēng)寒束肺、風(fēng)熱犯肺、熱毒熾盛、熱毒壅肺等。本研究運(yùn)用中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)對(duì)《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑手冊》中治療肺炎的處方進(jìn)行歸納、整理，分析配伍規(guī)律，篩選核心處方及核心藥物，然后進(jìn)一步采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析核心處方治療肺炎的作用機(jī)制，旨在為臨床治療提供依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)資料

1.1 處方來源與處方篩選 本研究使用中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)（V2.5）對(duì)《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑手冊》進(jìn)行分析?！吨腥A人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑手冊》由中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì)于1993年編著，它規(guī)范了中成藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和主流中成藥在臨床使用標(biāo)準(zhǔn)[2]，且共收錄了4 000余種中成藥。在平臺(tái)中的西醫(yī)診斷中輸入“肺炎”進(jìn)行搜索，篩選出治療肺炎的有效處方。

1.2 數(shù)據(jù)分析 通過軟件平臺(tái)中的“數(shù)據(jù)分析”模塊，挖掘中醫(yī)藥治療肺炎的用藥規(guī)律。運(yùn)用規(guī)則分析、頻數(shù)規(guī)律等數(shù)據(jù)挖掘方法，即使用“復(fù)雜系統(tǒng)熵聚類”“組方規(guī)律”等功能，得到治療肺炎的組方中各個(gè)藥物之間的使用頻數(shù)及藥物的關(guān)聯(lián)規(guī)則。

1.3 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的作用機(jī)制分析 通過藥物頻數(shù)統(tǒng)計(jì)、基于關(guān)聯(lián)規(guī)則的組方規(guī)律篩選治療肺炎的最佳處方，將所獲得的中藥輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫，得出有效化合物成分及藥物作用靶點(diǎn)，并且從GeneCards數(shù)據(jù)庫中獲取肺炎的疾病靶點(diǎn)基因，導(dǎo)入到R4.1.1數(shù)據(jù)包得到藥物與疾病的靶點(diǎn)交集，輸入Cytoscape 3.8.0軟件繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)一步進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觥?/p>

1.4 靶點(diǎn)的通路分析 為了解所篩選出的蛋白基因的功能以及其在肺炎疾病信號(hào)通路中的作用機(jī)理，首先將所有靶基因名稱通過Uniprot網(wǎng)站校正為其官方名稱，將篩選得到的靶點(diǎn)導(dǎo)入R4.1.1數(shù)據(jù)包；然后通過輸入所有靶標(biāo)基因名稱并將物種限制為人類，經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫檢索和轉(zhuǎn)化操作，設(shè)定顯著性程度P＜0.01；最后進(jìn)行GO生物學(xué)過程富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析將其分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 證候統(tǒng)計(jì) 運(yùn)用平臺(tái)對(duì)肺炎進(jìn)行中醫(yī)證候分析并做統(tǒng)計(jì)。熱毒熾盛證6次，痰熱蘊(yùn)肺證5次，熱毒蘊(yùn)腸證5次，風(fēng)熱犯肺4次，肺熱壅盛4次，溫毒犯表3次，熱毒攻喉3次，風(fēng)熱犯表3次，風(fēng)熱壅盛2次，心血瘀阻2次。（見圖1）

圖1 證候頻數(shù)圖

2.2 藥物性味歸經(jīng)分析 運(yùn)用軟件平臺(tái)中“統(tǒng)計(jì)報(bào)表”系統(tǒng)模塊中的“性味歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)”功能。對(duì)篩選出的34首處方中藥物所涉及的性味、歸經(jīng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。其中藥性以寒、溫為主，藥味以苦、甘、辛為主。歸經(jīng)以肺經(jīng)（109次）、胃經(jīng)（80次）、心經(jīng)（69次）、脾經(jīng)（45次）為主。（見圖2～4）

圖2 藥物四氣頻數(shù)圖

圖3 藥物五味頻數(shù)圖

圖4 藥物歸經(jīng)頻數(shù)圖

2.3 用藥頻數(shù)分析 經(jīng)分析得到可以治療肺炎方劑有34首，共包含中藥99味，用藥頻數(shù)在4次以上的共15味。排名前5味藥分別是黃芩、石膏、甘草、金銀花、苦杏仁。（見表1）

表1 用藥頻數(shù)≥4 的中藥

2.4 藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 分析得到的34首處方之間的關(guān)聯(lián)情況，使用網(wǎng)絡(luò)化展示得出用藥模式；選擇“規(guī)則分析”選項(xiàng)，置信度選擇0.8以上，所分析得到組合的藥物組合關(guān)聯(lián)規(guī)則見表2。

表2 藥物組合關(guān)聯(lián)規(guī)則

2.5 中藥處方基于關(guān)聯(lián)規(guī)則的組方規(guī)律 點(diǎn)擊“組方規(guī)律”進(jìn)行系統(tǒng)分析，并將支持度設(shè)置為5，置信度設(shè)置為0.6，根據(jù)藥物組合的頻數(shù)進(jìn)行排列，共得到13種用藥模式。（見表3）使用“新方聚類”功能得到10個(gè)核心組合。（見表4）

表3 常用藥物用藥模式

表4 用于熵聚類分析核心組合

2.6 核心處方及新方分析

2.6.1 核心處方分析 基于無監(jiān)督的熵層次聚類分析，分別采用支持度為3、置信度為0.7，支持度為4、置信度為0.6，支持度為5、置信度為0.6，分析治療肺炎的核心處方。最終獲得治療肺炎的核心組方為麻杏甘石湯加黃芩，進(jìn)一步通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析麻杏甘石湯加黃芩治療肺炎的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)展示圖見圖5。

圖5 不同支持度下關(guān)聯(lián)規(guī)則網(wǎng)絡(luò)化展示

2.6.2 新方分析 進(jìn)一步將相關(guān)度設(shè)置12，懲罰度為2，篩出5個(gè)治療肺炎的新處方。（見表5）

表5 基于熵層次聚類的新處方

2.7 所獲取的核心藥物的有效成分和作用靶點(diǎn) 支持度為5，置信度為0.6時(shí)可得到麻杏甘石湯加黃芩的治療肺炎核心藥物。將麻黃、苦杏仁、生石膏、甘草、黃芩輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫，通過生物利用度（OB）＞30%及類藥性（DL）＞0.18篩選得到麻黃23個(gè)有效成分，苦杏仁19個(gè)有效成分，甘草92個(gè)有效成分，黃芩36個(gè)有效成分，生石膏數(shù)據(jù)庫均無有效成分和靶點(diǎn)記錄在庫，通過查找文獻(xiàn)獲得其有效成分，故統(tǒng)計(jì)出170個(gè)有效成分。麻杏甘石湯加黃芩中部分有效活性物基本信息見表6。

表6 麻杏甘石湯加黃芩中部分活性化合物基本信息

2.8 藥物化合物作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 將所得出的有效化合物和靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0并繪制網(wǎng)絡(luò)圖，得到包括有效化合物241個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 025條邊，每條邊表示化合物分子與靶點(diǎn)之間的潛在作用關(guān)系。（見圖6）

圖6 麻杏甘石湯加黃芩潛在化合物-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.9 蛋白互作分析和網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?將篩選得到的基因輸入Cytoscape3.8.0中BisoGenet中繪制出蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），共得到2 980個(gè)節(jié)點(diǎn)，67 895條邊。（見圖7）使用CytoNCA插件對(duì)整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，還提出了度（degree）和介數(shù)（betweenness）等一系列可定量刻畫網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的度量，選擇DC模式，并選擇最小值61篩選得到網(wǎng)絡(luò)圖，篩選后共得到680個(gè)節(jié)點(diǎn)，26 194條邊。將所得到的網(wǎng)絡(luò)圖放大后選擇BC模式，選擇最小值600篩選得到網(wǎng)絡(luò)圖，篩選后共得到149個(gè)節(jié)點(diǎn)，3 636條邊，最后放大得到圖8。其中IL-6、AKT1、GSK3B、MAPK1、MAPK3、CDK2、CASP3、JUN及RELA等是麻杏甘石湯加黃芩主要活性成分的潛在靶點(diǎn)蛋白。

圖7 麻杏甘石湯加黃芩蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖8 麻杏甘石湯加黃芩治療肺炎的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鰣D

2.10 高頻藥物的GO分析和KEGG分析

2.10.1 高頻藥物GO分析 通過使用R4.1.1數(shù)據(jù)包對(duì)所篩選出的基因列表進(jìn)行GO富集分析功能，選取P＜0.01的20條通路得到氣泡圖。（見圖9）分子功能中排名前3的分別是DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性和RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。生物過程排名前3的分別是細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)和對(duì)類固醇激素反應(yīng)。細(xì)胞成分排名前3的是膜筏、膜微區(qū)和富含ficolin-1顆粒腔。

圖9 麻杏甘石湯加黃芩治療肺炎的GO 富集分析

2.10.2 KEGG分析 通過KEGG通路富集篩選得到146條信號(hào)通路，故選取P＜0.01的20條通路。（見圖10）這些基因在MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、p53信號(hào)通路（p53 signaling pathway）及Jak-STAT信號(hào)通路（Jak-STAT signaling pathway）上富集的較多。（見圖11～13）

圖10 麻杏甘石湯加黃芩作用靶點(diǎn)KEGG 富集分析的20 條通路

圖11 Jak-STAT 信號(hào)通路圖

圖12 p53 信號(hào)通路圖

圖13 MAPK 信號(hào)通路圖

3 討論

中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)結(jié)合了網(wǎng)絡(luò)科學(xué)的方法和技術(shù)，可應(yīng)用于總結(jié)名老中醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)特定疾病的用藥規(guī)律，篩選用藥頻數(shù)最高的核心藥物，從而指導(dǎo)新藥研發(fā)并進(jìn)行整理分析，有利于現(xiàn)代中醫(yī)的創(chuàng)新傳承[3]。中藥是一種多靶點(diǎn)、多組分的藥物，中藥復(fù)方更是如此。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是生物信息學(xué)中十分重要的組成部分，是非常注重整體性和系統(tǒng)性的新興學(xué)科[4]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可對(duì)中藥復(fù)方治療疾病的機(jī)制及通路做出可視化分析，是進(jìn)一步發(fā)展中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的新方法[5]。

3.1 中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)組方配伍分析 本研究運(yùn)用中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)對(duì)《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑手冊》中所記載的處方進(jìn)行篩選，最終篩選出治療肺炎的中藥復(fù)方34首。治療肺炎所應(yīng)用的中藥以寒性藥、溫性藥為主，其中寒性藥頻數(shù)為115次（70.55%），溫性藥頻數(shù)為25次（15.33%）。寒涼藥多有清熱、解毒、瀉火的功效，在治療肺炎里起到了清肅肺氣的作用。溫性藥多有溫中、散寒、助陽、補(bǔ)火等作用，在治療肺炎中起到了溫肺化飲的作用。篩選出的藥物多歸肺、胃、心、脾經(jīng)。其味以苦、甘、辛味為主，其中苦味藥頻數(shù)為97次（40.58%），甘味藥頻數(shù)為69次（28.87%），辛味藥頻數(shù)為56次（23.43%），味苦以降肺氣、味甘以補(bǔ)肺氣、味辛以宣肺氣[6]。熱毒熾盛證出現(xiàn)6次，痰熱蘊(yùn)肺證5次，熱毒蘊(yùn)腸證5次，即肺炎的發(fā)生多與“熱，毒，痰”有關(guān)。這與張利民等[7]關(guān)于肺炎證候研究的結(jié)果基本一致。麻杏甘石湯主治邪熱壅肺證，而黃芩能清熱燥濕，解氣分之熱，清上焦實(shí)熱，即解熱毒熾盛之熱[8]。

藥物頻數(shù)分析顯示，最常使用的中藥中前5味藥分別是黃芩（15次），石膏（9次），甘草（8次），金銀花（8次），苦杏仁（8次）。黃芩味苦，性寒，能清上焦之火，燥濕解毒。黃芩是《活人方》中所著清金丸的君藥[9]，其主治肺金枯燥，氣逆喘嗽，臟腑實(shí)火內(nèi)熾與現(xiàn)今肺炎疾病類似。研究表明，黃芩苷可用于治療肺炎、腫瘤及肝炎等疾病[10]?？嘈尤市晕?，味苦，歸肺經(jīng)、大腸經(jīng)。其主要用于治療肺氣上逆、反復(fù)咳喘不愈、大便干結(jié)?？嘈尤蕿橹箍绕酱帯？嘈尤实募状继崛∥锟嘈尤受湛梢酝ㄟ^分解成氫氰酸發(fā)揮鎮(zhèn)咳、平喘、抑制呼吸中樞的作用，從而治療肺炎[11]。甘草甘，平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳的功效。甘草中甘草酸的抗病毒作用較強(qiáng)，對(duì)肺炎有一定治療作用。楊曉露等[12]的研究證實(shí)了甘草總黃酮能有效抑制細(xì)胞上清中一氧化氮（NO）產(chǎn)物亞硝酸鹽含量，下調(diào)激活巨噬細(xì)胞中iNOS、COX-2的水平，抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號(hào)通路，上調(diào)PPAR-γmRNA的表達(dá)，從而達(dá)到抗炎效果[13]。金銀花味甘性寒，歸肺、胃經(jīng)，主清熱解毒。金銀花具有抗炎、清熱、抗病毒等多重藥理作用。金銀花水提液及金銀花醇對(duì)流感病毒有明顯抑制作用[14]。石膏味甘、辛，性大寒，歸肺、胃經(jīng)，主清熱瀉火、除煩止渴?，F(xiàn)代藥理研究[15]表明生石膏中富含Ca2+，可以通過抑制神經(jīng)肌肉的興奮性和調(diào)節(jié)血管通透性，來達(dá)到解痙及抗炎的作用，并且還對(duì)體溫調(diào)節(jié)中心有抑制作用，可以解熱而不出汗。麻黃性溫，味辛、微苦，歸肺、膀胱經(jīng)。麻黃的水煎劑、水提物和揮發(fā)油均有很好的解熱、平喘、鎮(zhèn)咳，抗炎等作用，麻黃中所含的麻黃堿、偽麻黃堿可以通過興奮支氣管平滑肌的β受體來松弛平滑肌，并興奮黏膜血管平滑肌α受體來收縮血管，以達(dá)到平喘的目的[16]。

本研究篩選出的核心處方為麻杏甘石湯加黃芩。麻杏甘石湯首出自《傷寒論·辨太陽病脈證并治法》[17]，后世醫(yī)家多將其用于風(fēng)寒化熱，或風(fēng)熱犯肺，或見肺中熱盛，身熱喘咳，口渴脈數(shù)等證的治療。麻杏甘石湯具有清涼解表、清肺平喘的功效，是治療肺炎的常用方劑。

3.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析核心處方的作用機(jī)制 麻杏甘石湯加黃芩化合物成分、靶標(biāo)基因與疾病靶點(diǎn)之間具有50個(gè)交集靶點(diǎn)，中心靶點(diǎn)為IL-6、AKT1、GSK3B、MAPK1、MAPK3、CDK2、CASP3、JUN以及RELA。IL-6具有多種生物學(xué)功能，是急性時(shí)相反應(yīng)的有效誘導(dǎo)劑。IL-6在B細(xì)胞最終分化為參與淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞分化的免疫球蛋白分泌細(xì)胞中起重要作用[18]。同時(shí)IL-6也是肺炎診療方案臨床的重要指標(biāo)[19]，對(duì)肺炎的治療起重要作用。這些靶點(diǎn)可能是麻杏甘石湯加黃芩治療肺炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)及作用機(jī)制之一。GO富集分析結(jié)果顯示，麻杏甘石湯加黃芩可能通過影響與DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的蛋白質(zhì)，與基因調(diào)控區(qū)內(nèi)的特定DNA序列相互作用以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，通過調(diào)節(jié)特定DNA序列的轉(zhuǎn)錄表達(dá)達(dá)到防治肺炎的目的。KEGG通路富集分析篩選得到了MAPK信號(hào)通路、p53信號(hào)通路及Jak-STAT信號(hào)通路等信號(hào)通路。其中MAPK通過激活NF-κB的活性，可以使促炎性細(xì)胞因子大量釋放，還可通過JNK激活c-Jun來控制細(xì)胞凋亡[20]。p53信號(hào)通路由多種應(yīng)激信號(hào)誘導(dǎo)，能使PKB/Akt通過去磷酸化激活NF-κB的活性，通過DNA調(diào)節(jié)COX-2活性來促進(jìn)血管生成[21]。Jak-STAT信號(hào)通路可以通過與MAPK信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步介導(dǎo)炎癥和免疫調(diào)節(jié)等作用[22]。這些作用靶點(diǎn)與通路相互影響，可能是麻杏甘石湯加黃芩治療肺炎的可能作用機(jī)制之一，其具體作用機(jī)制有待繼續(xù)探討。