同型半胱氨酸對肝細胞增殖及CyclinD1?ALT和AST表達的影響*

蔡 欣,楊曉玲,楊 程,曹成建,王 磊,田 玨,張 焱,姜怡鄧△

(寧夏醫(yī)科大學:1.檢驗學院;2.基礎學院病理生理教研室;3.心血管疾病基礎研究重點實驗室;4.科技中心,寧夏銀川 750004)

同型半胱氨酸對肝細胞增殖及CyclinD1?ALT和AST表達的影響*

蔡 欣1,楊曉玲2,3,楊 程1,曹成建1,王 磊1,田 玨2,3,張 焱4,姜怡鄧2,3△

(寧夏醫(yī)科大學:1.檢驗學院;2.基礎學院病理生理教研室;3.心血管疾病基礎研究重點實驗室;4.科技中心,寧夏銀川 750004)

目的探討同型半胱氨酸(Hcy)對肝細胞增殖及細胞周期素D1(CyclinD1)?丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)表達的影響?方法 將HL-7702細胞體外常規(guī)培養(yǎng),分別用0?50?100?200?500μmol/L Hcy刺激細胞,分別于刺激后6?12?24h采用MTT法檢測肝細胞的增殖情況;采用熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測CyclinD1mRNA的表達;采用微板法檢測各組細胞培養(yǎng)液中ALT和AST的變化?結果不同濃度Hcy刺激肝細胞不同時間后,細胞的增殖受到抑制,其中100?200?500μmol/L Hcy組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),24h作用最明顯;不同濃度 Hcy刺激肝細胞24h后,CyclinD1mRNA的表達顯著下降(P0.01),細胞培養(yǎng)液中ALT和AST水平顯著升高(P0.01)?結論Hcy可以抑制肝細胞增殖,并引起CyclinD1的mRNA表達下降,ALT和AST釋放增多?

肝細胞;細胞增殖;同型半胱氨酸;細胞周期素D1;丙氨酸轉氨酶;天冬氨酸氨基轉移酶

同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)作為動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的獨立危險因子[1-2],其致 AS的機制有脂代謝紊亂?平滑肌細胞增殖?炎性反應等,其中脂代謝紊亂是重要環(huán)節(jié)[3]?Hcy屬于氨基酸類物質,不直接參與脂代謝,因此Hcy如何能引起脂代謝紊亂,值得進一步研究?肝臟是機體脂質代謝的主要場所,肝細胞是肝臟的基本組成單位,當肝細胞數(shù)量減少或功能損傷時,就會引起肝臟脂質代謝紊亂及脂質在體內堆積[4],進而導致高脂血癥,促進 AS的發(fā)生?發(fā)展[5]?體內Hcy的代謝主要在肝臟進行[6],但 Hcy對肝細胞數(shù)量和功能的影響目前研究尚不明確?本研究擬用不同濃度Hcy刺激肝細胞,分析Hcy對肝細胞增殖及細胞周期素D1(CyclinD1)?ALT和AST的影響?

1 材料與方法

1.1 材料 主要儀器:CO2培養(yǎng)箱(HF90,Heal Force);倒置顯微鏡(Nikon公司);高速低溫離心機(Heraeus公司);酶標儀(Model680,Bio-Rad)?試劑:1640培養(yǎng)基?胎牛血清(Gibco,美國);青霉素-鏈霉素溶液(碧云天,江蘇);PBS緩沖液?胰蛋白酶(吉諾,杭州);同型半胱氨酸?二甲基亞砜(DMSO)(Sigma,德國);MTT(凱基,南京);RNA 提取試劑 Trizol(Invitrogen,美國);逆轉錄試劑盒?SYBR實時定量PCR(RT-qPCR)Master Mix(全式金,北京);丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒(建成生物,南京)?

1.2 方法

1.2.1 肝細胞的培養(yǎng)及分組 人肝細胞株HL-7702購于中南大學湘雅細胞庫,肝細胞用含10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),置于37℃?含5%CO2的培養(yǎng)箱中?當細胞密度達到80% 時,將細胞隨機分為5組,分別用含0?50?100?200?500μmol/L Hcy的培養(yǎng)液刺激細胞,其中0μmol/L Hcy組為對照組,將各組細胞置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后收集細胞,用于后續(xù)指標的檢測?

1.2.2 MTT檢測 常規(guī)培養(yǎng)人肝細胞至細胞密度達到80%時,用0.25% 胰蛋白酶消化細胞1min,然后加入含10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸,以50μL/孔的細胞重懸液接種于96孔板中,在37℃?5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,吸出各孔內的培養(yǎng)液,換成含0?50?100?200?500μmol/L Hcy的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),分別于6?12?24h后,加入50μL MTT工作液,置于培養(yǎng)箱中4h,然后小心吸出上清液,每孔加入150μL DMSO,震蕩10min使結晶充分溶解,用酶標儀在490nm處檢測各孔的光密度(OD)?細胞增殖率(%)=(加藥細胞OD/對照細胞OD)×100%?

1.2.3 RT-qPCR檢測 用Trizol提取各組細胞的總RNA,核酸分析儀分析純度后,選取260nm和280nmOD值之比(OD260/OD280)為1.7～1.9的RNA用于實驗?根據(jù)公布的CyclinD1(GenBank No.49457150)序列用Premier 5.0設計引物,上 游:5′-GTC GCT GGA GCC CGT GAA-3′,下 游:5′-CGG ATG GAG TTG TCG GTG TAG-3′,擴增產(chǎn)物長度為132bp?GAPDH 上游:5′-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3′,下游:5′-AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3′,擴增產(chǎn)物長度為146bp?按逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA并取產(chǎn)物3μL,在 PCR管內加入SYBR RT-qPCR Master Mix 12.5μL,上?下游引物各0.5μL,加去離子水使整個反應體系為25μL,設定PCR的條件:94℃預變性5min,94℃變性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,擴增40個循環(huán)?根據(jù)公式計算結果:目的基因的相對量=2-△△Ct,Ct為熱循環(huán)儀檢測到反應體系中熒光信號的強度值,△△Ct=[Ct(待測樣品)-Ct GAPDH(待測樣品)]-[Ct(校正樣品)-Ct GAPDH(校正樣品)]?校正樣品是任何被選做代表1倍目的基因表達量的樣品?

1.2.4 細胞培養(yǎng)液ALT和AST水平的檢測 將細胞分為對照組及50?100?200?500μmol/L Hcy組,置37 ℃?5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后收集各組細胞培養(yǎng)液,按試劑盒說明書要求,先將基質液置37℃預溫,加入待測樣本后反復吹打混勻,37℃水浴30min,然后分別加入2,4-二硝基苯肼液和0.4 mol/L氫氧化鈉溶液,輕輕水平搖動96孔板混勻,室溫放置15min,使用酶標儀在510nm處檢測每孔的OD值(絕對OD值=測定孔OD值-對照孔OD值),根據(jù)標準曲線,計算ALT/AST活力單位?

1.3 統(tǒng)計學處理 采用Prism5.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量資料以±s表示,兩樣本均數(shù)間比較采用Student′st檢驗,多樣本均數(shù)間比較采用One-way ANOVA檢驗,組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗,以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義?

2 結 果

2.1 Hcy各濃度在不同時間對肝細胞增殖的影響 不同濃度的Hcy刺激肝細胞后,肝細胞的增殖均受到抑制,且隨著Hcy濃度的增加,肝細胞增殖率降低,其中100?200?500μmol/L Hcy組肝細胞的增殖率與對照組比較顯著下降(P0.01),見表1?Hcy作用肝細胞6?12?24h后,細胞的增殖受到抑制,其中24h組肝細胞的增殖率顯著下降,與6?12h相應組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)?

2.2 細胞增殖相關基因CyclinD1mRNA的變化 CyclinD1 mRNA檢測的結果和MTT結果基本一致?與對照組比較,各Hcy組CyclinD1表達隨Hcy濃度的增加而降低,50μmol/L Hcy組CyclinD1mRNA水平為對照組的71.51%(P0.05);100?200?500μmol/L Hcy組 CyclinD1mRNA水平分別為對照組的 50.33%?41.33%?29.97%,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),見圖1?2?

表1 各組肝細胞增殖率比較(±s,n=5,%)

表1 各組肝細胞增殖率比較(±s,n=5,%)

a:P 0.01,與對照組比較;b:P0.05,c:P 0.01,與同組6h比較;d:P0.05,與同組12h比較?

組別6h 12h 24h對照組1.18±0.08 1.75±0.04 1.77±0.03 50μmol/L Hcy組 1.78±0.05 1.73±0.04 1.71±0.03 100μmol/L Hcy組 1.43±0.02a 1.36±0.04ab 1.09±0.04acd 500μmol/L Hcy組 1.09±0.01a 1.03±0.08ab 0.64±0.02acd

圖1 各組肝細胞CyclinD1mRNA表達的擴增曲線

圖2 各組肝細胞CyclinD1mRNA表達比較

圖3 各組肝細胞培養(yǎng)液中的ALT水平比較

2.3 細胞培養(yǎng)液ALT和AST水平的檢測 與對照組比較,

各Hcy組ALT和AST水平隨Hcy濃度的增加而增加,50 μmol/L Hcy組的肝細胞上清液中ALT水平為對照組的1.90倍(P0.05);100?200?500μmol/L Hcy刺激后,ALT水平分別是對照組的2.61?3.80?5.10倍,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)?AST水平在100?200?500μmol/L Hcy組也分別是對照組的3.28?4.36?5.97倍,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),見圖3?4?

3 討 論

肝臟是全身脂代謝最重要的器官,也是合成和降解Hcy的主要部位,當肝細胞受損時,會引起脂質代謝紊亂和Hcy在體內聚積,進而導致高脂血癥和高Hcy血癥,促進AS的發(fā)生?發(fā)展?研究發(fā)現(xiàn),Hcy與多種肝臟疾病密切相關,Hcy可誘導肝臟氧化應激,促進炎癥細胞浸潤并降低大鼠肝臟糖原/糖蛋白水平[7],在非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)患者血漿中 Hcy水平較正常人顯著升高,推測Hcy可能通過影響肝臟功能引起AS?肝細胞是肝臟最基本的結構和功能單位,當肝細胞受到各種因素刺激或損傷后致其細胞數(shù)量減少時,可進一步引起肝細胞功能降低?Xagorari等[8]證實急性肝損傷后細胞數(shù)量明顯下降,肝臟可出現(xiàn)凋亡;有研究報道肝癌病程進展中肝細胞的存活率顯著下降[9-10]?

本實驗結果顯示,50μmol/L Hcy對肝細胞增殖沒有明顯抑制作用,而100?200?500μmol/L Hcy在體外能顯著抑制肝細胞的增殖,使肝細胞數(shù)量減少?由于高濃度的Hcy具有細胞毒性,可以導致細胞凋亡[11],因此在本研究中,當Hcy濃度超過50μmol/L后,所測得細胞增殖率下降的原因除了與細胞增殖受到抑制有關,也有可能是高濃度Hcy誘導了細胞凋亡所致,為了盡量降低Hcy的細胞毒性對實驗結果的影響,本研究在能引起肝細胞增殖率明顯下降的Hcy濃度中挑選最小劑量,即100μmol/L用于后續(xù)實驗研究?Hcy作用肝細胞24h后,肝細胞的增殖率明顯降低,與6?12h比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)?因此,可以將100μmol/L Hcy作用 HL-7702細胞24h用于Hcy對肝細胞影響的研究,這為后續(xù)進一步分析Hcy對肝細胞結構和功能的作用奠定了基礎?

CyclinD1基因由染色體11q13上CCND1基因編碼,是Cyclins家族成員之一,屬細胞周期正調控因子?CyclinD1促使細胞從G期順利進入S期,使細胞發(fā)生分裂和增殖[12],其表達受到抑制時會造成細胞增殖率的下降?CyclinD1與肝臟疾病的發(fā)生?發(fā)展密切相關,李啟炯等[13]研究證實,CyclinD1在肝細胞癌中表達升高,是肝細胞肝癌預后的獨立危險因素?本實驗結果顯示,隨著 Hcy濃度增加,100?200?500μmol/L Hcy組CyclinD1mRNA水平逐漸下降,與肝細胞的增殖率變化趨勢一致?本研究結果進一步提示,不同濃度Hcy引起細胞增殖率的下降可能與抑制細胞增殖有關,但不能排除細胞凋亡在其中也起一定作用?

目前,臨床常用于判斷肝臟疾病診斷與預后的血清學指標主要包括ALT和AST[14]?ALT和AST作為肝細胞功能損害最敏感最常用的檢測指標,主要存在于肝細胞的細胞質內,當肝細胞受損時就會釋放入血,導致血清中的ALT和AST水平大幅度上升?本實驗結果顯示,100?200?500μmol/L Hcy組細胞培養(yǎng)液中ALT和AST水平明顯升高,表明Hcy能夠損傷肝細胞使其功能降低,提示Hcy對肝細胞增殖率的影響可能會進一步導致肝細胞功能的下降?

綜上所述,Hcy可抑制肝細胞增殖,同時引起CyclinD1的mRNA表達下降以及肝細胞功能的降低?肝細胞凋亡是否在其中起一定作用有待進一步研究?本研究結果為進一步揭示Hcy促進AS的機制提供了新思路?

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Effect of homocysteine on proliferation and expression of CyclinD1,ALT and AST in hepatic cells*

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(:1.;2.,,;3.;4.,,750004,)

ObjectiveTo explore the effects of homoysteine(Hcy)on the proliferation of hepatic cells and the expression of CyclinD1,ALT and AST.MethodsHL-7702hepatic cells were routinely cultured in vitro and irritated with Hcy at a concentration of 0,50,100,200,500μmol/L,respectively.The proliferation of hepatic cells was measured by MTT at 6,12,24hafter irritation.The expression of CyclinD1mRNA was detected by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-qPCR).The changes of ALT and AST in the cells culture medium of each group were determined by the microplate method.ResultsThe proliferation of hepatic cells was inhibited by different concentrations of Hcy,in which the proliferation rates irritated by Hcy at the concentrations of 100,200,500μmol/L were lower than that in control group with statistical difference(P0.01),and the effect was most markedly at 24hafter irritation(P0.01);compared with the control group,when hepatic cells were irritated by Hcy at the concentrations of 100,200,500μmol/L for 24h,the mRNA expression of CyclinD1was decreased(P0.01),meanwhile the levels of ALT and AST were significantly increased(P0.01).ConclusionHcy can inhibit the proliferation of hepatic cells,cause the decrease of CyclinD1mRNA expression and result in the increase of ALT and AST release.

hepatocytes;cells proliferation;homocysteine;CyclinD1;alanine transaminase;aspartate aminotransferases

10.3969/j.issn.1671-8348.2014.12.020

A

1671-8348(2014)12-1468-03

* 基金項目:國家自然科學基金資助項目(81260063?81260105?81160044)?

蔡欣(1987-),在讀碩士研究生,主要從事動脈粥樣硬化的分子生物學診斷研究工作?△

,Tel:(0951)6980998;Email:jiangyideng123@163.com?

2013-11-18

2013-12-26)

?短篇論著?