小鼠胰腺腺泡細胞鈣振蕩的激光共聚焦成像研究方法*

王靜柯，趙夢琴，孫娜娜，孫芳芳，吳 杰，2，沈建新△，王海燕

胰腺腺泡細胞在體內(nèi)受副交感神經(jīng)末梢釋放的乙酰膽堿（acetylchloline，ACh）調(diào)節(jié)，可分泌含酶胰液。體外研究發(fā)現(xiàn)ACh作用于胰腺腺泡細胞可產(chǎn)生鈣振蕩（calcium oscillations），表現(xiàn)為胞漿內(nèi)鈣信號的節(jié)律性升高和恢復(fù)。普遍認為，胰腺腺泡細胞鈣振蕩（pancreatic acinar cell calcium oscillations，PACCOs）與含酶胰液的分泌密切相關(guān)；而且，ACh作用于胰腺腺泡細胞并使后者產(chǎn)生鈣振蕩這一反應(yīng)形式可成為研究相關(guān)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的實驗?zāi)Ｐ停?-3］。

測定PACCOs的方法主要有二種：間接法和直接法。間接法：主要是利用全細胞膜片鉗技術(shù)，記錄在細胞外液中加入興奮劑（如ACh）后胞漿Ca2＋濃度變化所激活的Cl-通道電流，通過Cl-通道電流間接反映 PACCOs的情況［4］。直接法：利用鈣熒光指示劑與胞內(nèi)Ca2＋結(jié)合后在相應(yīng)波長的激發(fā)光作用下可發(fā)出特定波長的熒光的特點，通過熒光顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡（laser scanning confocalmicroscope，LSCM）或雙光子顯微鏡等儀器檢測興奮劑作用后引起的鈣熒光變化，直接研究 PACCOs［1，3］。

本研究主要探討建立一種簡單易行而高效的PACCOs的LSCM成像研究方法，屬直接法。選用的成年昆明小鼠，用膠原酶法急性分離得胰腺腺泡細胞，加熒光染料fluo-4-AM標(biāo)記胞內(nèi)鈣；以乙酰膽堿（ACh）為興奮劑作用于胰腺腺泡細胞，利用LSCM發(fā)射488 nm激光激發(fā)fluo-4和Ca2＋的復(fù)合物產(chǎn)生熒光并同步、實時、動態(tài)地記錄此過程中的PACCOs，以建立一種可作為常規(guī)方法使用的小鼠PACCOs的LSCM成像研究方法。

1 材料與方法

1.1 胰腺腺泡細胞懸液制備

根據(jù)文獻［4，5］并作適當(dāng)改進，簡要方法如下：取4～6個月（40～60 g）的昆明小鼠（由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供）稱重，麻醉，頸椎脫臼處死；打開小鼠腹腔，取胰腺，用注射器向胰臟中注入膠原酶（日本 Wako公司）液（150～200 U／ml）0.5ml（以標(biāo)準(zhǔn)液配制）；使酶液充滿其內(nèi)部，再將整個胰臟放入盛膠原酶的離心管中，37℃水浴搖床消化10 min，取出用手振搖至有組織碎屑脫落；繼續(xù)消化10 min后取出，搖勻；取膠原酶管中上層的細碎組織懸液至有2 ml細胞標(biāo)準(zhǔn)液的離心管中，用移液器吹打約100次，加標(biāo)準(zhǔn)液至 5 ml，1 000 r／min離心 1 min，棄上清；再加2ml標(biāo)準(zhǔn)液，重復(fù)以上操作3次，最后棄上清，加入適量標(biāo)準(zhǔn)液用移液器輕輕吹勻即得胰腺腺泡細胞懸液。標(biāo)準(zhǔn)液成分如下（g）：NaCl 8.18、KCl 0.34、CaCl20.11、MgCl20.131、HEPES 2.38、Glucose 1.80。

1.2 共聚焦成像觀察與數(shù)據(jù)采集

取適量胰腺腺泡細胞懸液于標(biāo)本槽中，待細胞貼壁后，加入鈣熒光染料fluo-4-AM（終濃度20μmol／L）避光負載20 min，標(biāo)準(zhǔn)液灌流10 min即可開始用LSCM（型號為 Olympus FV-1000，配有 488 nm激光，20×和40×鏡頭）觀察記錄。掃描方式為連續(xù)二維掃描法（XYT）：單張圖片分辨率為512×512，相鄰兩圖片間時間間隔1.6 s，連續(xù)掃描200到400張圖片，覆蓋加藥前、加藥過程和加藥后的全過程，同步、實時、動態(tài)地記錄此過程中胰腺腺泡細胞在加入ACh后產(chǎn)生的鈣振蕩。實驗在室溫下進行，實驗過程中保持胞外灌流標(biāo)準(zhǔn)液以維持細胞良好活性；ACh以標(biāo)準(zhǔn)液配制，通過靠近細胞的灌流小管施加（圖1）。

1.3 數(shù)據(jù)的處理分析

綜合應(yīng)用Olympus Fluoview（共聚焦顯微鏡自帶的軟件）、ImageJ（美國NIH開發(fā)的免費圖像軟件）和Excel VBA編程的方法實現(xiàn)對圖像數(shù)據(jù)的有效處理和統(tǒng)計分析。Olympus Fluoview可將原始圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為tif格式的系列圖片，ImageJ可對tif格式的系列圖片進行靈活的圖像處理和灰度測量，Excel VBA編程則可將ImageJ測量所得的結(jié)果自動進行匯總、處理和統(tǒng)計分析。從鈣振蕩圖像中我們提取的主要參數(shù)是平均鈣釋放量和鈣振蕩的頻率。鈣振蕩頻率以Hz表示，平均鈣釋放量則以△F／F0表示，其中，F(xiàn)0為靜息情況下的鈣熒光強度。實驗設(shè)計以自身對照為主，統(tǒng)計處理用SPSS 13.0軟件進行分析，多組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析。

Fig.1 Diagram to show how to record adultmouse PACCOs using LSCM imagingA：The perfusion system；B：The LSCM imaging system；C：The computer；PACCOs：Pancreatic acinar cell calcium oscillations；LSCM：Laser scanning confocalmicroscope

2 結(jié)果

2.1 胰腺腺泡細胞鈣振蕩的共聚焦成像記錄

急性分離的小鼠胰腺腺泡細胞在光鏡下呈圓形、橢圓形或腎形，且經(jīng)常兩個或三個抱團存在，可分清分泌極（酶原顆粒集中處）和基底極；抱團存在時往往是分泌極相向靠近，而基底極朝外（圖2A）。負載上鈣熒光染料后，腺泡細胞在488 nm的激光激發(fā)下發(fā)出較均勻熒光（圖2B）。將對應(yīng)的光鏡照片和熒光照片疊加則可觀察胞內(nèi)不同部位的鈣熒光信號的分布情況（圖2C）。通過灌流加藥系統(tǒng)對胰腺腺泡細胞施以100 nmol／L的ACh，則可看到細胞內(nèi)的鈣熒光信號出現(xiàn)一定頻率的明暗變化過程（圖2D），這就是PACCOs。腺泡細胞鈣熒光系列圖片可用ImageJ進行熒光強度測量，之后經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理，即可得到胞內(nèi)鈣熒光強度（△F／F0）-時間曲線（圖2E，2G）。如在用標(biāo)準(zhǔn)液（SL）灌流時加入毒蕈堿型受體（M受體）阻斷劑阿托品（atropine 1μmol／L），之后再加入ACh，則看不到胞內(nèi)鈣熒光強度的變化（圖2F）。這說明，阿托品可完全阻斷ACh激發(fā)的胞內(nèi)鈣振蕩，而ACh則是通過M受體激發(fā)腺泡細胞產(chǎn)生胞內(nèi)鈣振蕩的。這與文獻中報道腺泡細胞膜上存在M3受體的事實是相一致的［6］。

Fig.2 PACCOs were induced by ACh steadily throughmuscarinic receptorsA：Visible light pancreatic acinar cells；a：The secretory pole；b：The basal pole；B：Fluorescent pancreatic acinar cellswith fluo-4 by confocalmicroscopewith 488 nm laser；C：Themerging image from A and B；D：A series of images to show Ca2＋ fluorescent change for PACCOs，the dashed circles show the areas tomeasure，and the numbers on the upper left corner（1～12）match with the numbers（1～12）in G；E：PACCOs were induced by ACh（100 nmol／L）steadily；F：PACCOs induced by ACh were blocked completely by Atr（1 μmol／L），amuscarinic receptor blocker；G：The enlargement ofmarked area in E，and the numbers（1～12）match with those in D；ACh：Acetylcholine；Atr：Atropine；SL：Standard solution；PACCOs：Pancreatic acinar cell calcium oscillations

2.2 胰腺腺泡細胞胞間和胞內(nèi)不同部位鈣振蕩的特點

在連續(xù)二維掃描模式下，同一視野下的所有細胞的鈣熒光信號變化都可被同時記錄到。通過比較研究同一實驗條件下不同細胞的鈣振蕩特點發(fā)現(xiàn)，同一視野下的不同細胞對于同一濃度的ACh（100 nmol／L）可有不同反應(yīng)（圖 3A）：有的細胞對 ACh比較敏感，加藥不久后即可記錄到典型的鈣振蕩，有的則要過長一點的時間才產(chǎn)生鈣振蕩；有的鈣振蕩幅度較大，有的則較??；有的頻率較快，有的則較慢；有的鈣振蕩時程較短，有的則較長；還有的細胞根本對所施加的ACh沒有任何反應(yīng)。但對于抱團存在的細胞往往比較有規(guī)律可循：其中某一個細胞先產(chǎn)生鈣振蕩，然后鄰近的細胞才出現(xiàn)鈣振蕩，有一定順序，如此往復(fù)（圖3B），比較同步。如果把圖片分辨率增大，使同一視野下的細胞數(shù)減少而細胞的圖像更清晰，這時我們可對胞內(nèi)不同部位的鈣熒光信號變化進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：同一細胞內(nèi)不同部位（如分泌極和基底極）的鈣振蕩幅度雖然不同（基底極的幅度要高于分泌極）但幾乎同時產(chǎn)生且頻率一致（圖3C，3D）。

Fig.3 Features of Ca2＋oscillations among pancreatic acinar cells and among different zones inside one cellA：Ca2＋oscillations induced by ACh of different cells in one visual field；B：Ca2＋oscillations ofgrouped cells；1，2 and 3 in A and B：Cell numbers；C：Ca2＋ oscillations of different zones inside one cell；1 in C：The secretory pole，2 in C：The basal pole；a：Visible light image；b：The fluorescent image，Dashed circles：the areas tomeasure；c：The time course of Ca2＋oscillations and the numbersmatch with the numbers in the left image；D：The enlargement of marked area in C；ACh：Acetylcholine；SL：Standard solution

2.3 胰腺腺泡細胞鈣振蕩與ACh劑量的關(guān)系

為了可靠地探討不同濃度的ACh對PACCOs的影響，我們采用了間隔兩段式自身對照的實驗設(shè)計。具體的實施過程如下：ACh分兩段施加，第一段的給藥濃度為 100 nmol／L，時間約 130 s；第二段（約 130 s）的給藥濃度分別為 50 nmol／L，100 nmol／L和 200 nmol／L（圖 4A），兩段之間的時間間隔約 130 s。數(shù)據(jù)分析時選取第一段反應(yīng)良好（△F／F0≥0.2，頻率約0.05 Hz）的細胞，分別計算其第二段反應(yīng)的幅度和頻率與第一段反應(yīng)的幅度和頻率的比值（圖4B，4C），從而分析ACh的劑量依賴效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：一定濃度范圍內(nèi)（50 nmol／L～200 nmol／L），ACh的濃度越大，其激發(fā)的鈣振蕩幅度越大，鈣振蕩的頻率也越高（圖 4）。

3 討論

Fig.4 Dose dependence of ACh for inducing PACCOsA：Representative time courses of Ca2＋oscillations induced by variable concentrations of ACh（50～200 nmol／L）；B：Ratios of Ca2＋oscillation amplitudes via 2nd segment VS 1st segment（the normalized Ca2＋release）；C：Ratios of Ca2＋ oscillation frequencies via 2nd segment VS 1st segment（the normalized Ca2＋ oscillation frequencies）**P＜0.01，*P＜0.05

用直接法研究PACCOs在不少文章中有提及，但不夠具體，且多是作為其他方法的補充，印證其他方法的準(zhǔn)確性，還較少作為一種常規(guī)方法使用。本文探討了利用LSCM觀察和記錄ACh激發(fā)的PACCOs的方法，并對正常情況下PACCOs的特點進行較系統(tǒng)的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LSCM下可直觀而方便地記錄到ACh激發(fā)的急性分離的小鼠PACCOs，且此反應(yīng)可被毒蕈堿型受體（M受體）阻斷劑阿托品完全阻斷，說明此類鈣振蕩是通過M型受體相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生的，這與以前的相關(guān)研究相一致（圖2）［6］。在此基礎(chǔ)上，利用 LSCM可進行二維連續(xù)掃描的特點，觀察比較了同一視野下不同細胞的鈣振蕩的特點，發(fā)現(xiàn)不同細胞的鈣振蕩在反應(yīng)幅度和反應(yīng)頻率等方面各不相同（圖3A），而抱團存在的細胞反應(yīng)比較同步（圖3B）；如提高圖像的分辨率則可對同一細胞內(nèi)的不同部位進行分區(qū)觀察，發(fā)現(xiàn)同一細胞內(nèi)的分泌極部位的鈣振蕩幅度比基底極部位的低，但頻率完全一致（圖3C，D）。這使我們對ACh激發(fā)的 PACCOs的認識更全面［2，3］。

本研究結(jié)果表明，對同一細胞先后兩次施加同一濃度的ACh并不能得到完全一樣的結(jié)果，而是第二次給藥得到的效應(yīng)往往弱于第一次。這可能與激光的照射和染料對細胞的生理功能有不利影響有關(guān)，也可能與相關(guān)受體的去敏感化有關(guān)，但目前尚未見有相關(guān)的定量研究和分析的文章。為了避開LSCM的這種可能弊病，本研究采用兩段式的自身對照實驗設(shè)計方法，可靠地研究了激發(fā)PACCOs的激動劑ACh的劑量依賴效應(yīng)。這種兩段式的實驗設(shè)計有如下好處：（1）通過第一段的反應(yīng)可對細胞進行初篩，去除反應(yīng)異常的細胞；（2）以每個細胞第二段與第一段反應(yīng)的比值反映鈣振蕩的特點，可系統(tǒng)地消除激光和染料的影響，而且使不同細胞間反應(yīng)的比較更合理。采用類似的實驗設(shè)計方法，我們也可方便而可靠地利用LSCM成像方法檢測各種相關(guān)藥物對PACCOs的影響，這對于本方法的推廣應(yīng)用有重要意義。

從本文結(jié)果可以看出，與間接法的全細胞膜片鉗記錄技術(shù)［4］相比，PACCOs的LSCM成像研究法有如下優(yōu)點：（1）LSCM成像法的記錄結(jié)果為圖像數(shù)據(jù)，可做成動畫再現(xiàn)鈣信號變化過程，形象直觀，而膜片鉗法記錄則做不到；（2）膜片鉗一般只能鉗制一個細胞，而在LSCM的連續(xù)掃描模式下，可同時觀察記錄視野下多個細胞的鈣信號變化情況，效率較高；（3）LSCM法同時對多個細胞的記錄還有利于比較研究不同細胞間的鈣信號變化關(guān)系，這是膜片鉗技術(shù)難以做到的；（4）另外LSCM法還可通過測量同一細胞不同部位的鈣熒光強度以研究同一細胞內(nèi)不同部位的鈣信號變化關(guān)系，這也是膜片鉗技術(shù)所做不到的。當(dāng)然，膜片鉗法有一個優(yōu)點是LSCM法所不具備的：膜片鉗可通過微電極實現(xiàn)胞內(nèi)給藥，研究胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的各個環(huán)節(jié)，在機制研究方面有重要作用。不過，在條件具備時，LSCM法可與膜片鉗法聯(lián)用，二者取長補短，形成高效能的研究系統(tǒng)［7，8］。另外，膜片鉗法的技術(shù)難度較高，需要較長時間的練習(xí)才能熟練掌握；LSCM法則相對簡單易學(xué)，利于推廣應(yīng)用。

總之，通過本研究成功地建立了可作為常規(guī)方法使用的小鼠PACCOs的LSCM成像研究方法。結(jié)果證實：該方法穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，且具有簡單、易行、直觀、高效（可實時記錄同一視野內(nèi)多個細胞的鈣信號動態(tài)變化）、靈活（既可觀察各個細胞的信號變化，也可觀察胞內(nèi)各部位間或不同細胞間信號變化的關(guān)系，還可與膜片鉗記錄法聯(lián)用進行更深入、精細的研究）等特點，具有良好的應(yīng)用前景和推廣價值。

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