高脂飲食對慢性低氧大鼠肺組織eNOS／NO的影響*

趙艷霞，李玉紅，王亞平，楊應(yīng)忠，馬 蘭，格日力△

（1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧810001；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院，西寧810001）

由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化產(chǎn)生的一氧化氮（nitric oxide，NO）是一種細(xì)胞信號分子，可調(diào)節(jié)血管張力、維持血管穩(wěn)態(tài)，對肺組織結(jié)構(gòu)和功能有多重保護(hù)作用［1-3］。

肺組織NO含量被認(rèn)為是高原低氧適應(yīng)與習(xí)服的重要指標(biāo)［4，5］。NO含量相應(yīng)升高則低氧引起的肺動脈高壓、肺水腫等肺部疾病發(fā)生率降低；NO含量降低，則易引起低氧相關(guān)肺部疾病。慢性低氧可引起機(jī)體氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致活性氧成分（reactive oxygen species，ROS）增加，ROS通過直接清除 NO和使eNOS脫偶聯(lián)減少NO的產(chǎn)生而降低NO的生物利用度，導(dǎo)致肺血管舒張功能障礙及平滑肌細(xì)胞增殖，引起肺血管收縮及結(jié)構(gòu)異常，進(jìn)而引起肺部疾?。?-7］。已知除慢性低氧，高脂血癥是影響肺組織NO含量又一重要因素［8，9］。高原低溫低氧環(huán)境致使高原人群多有高脂飲食習(xí)慣，研究表明高原人群高脂血癥發(fā)病率較平原增高［10］，然而，高脂血癥對低氧環(huán)境人群肺組織的影響尚未見報(bào)道。

本研究通過分析高脂飲食對慢性低氧SD大鼠肺組織eNOS／NO的影響，探討其可能機(jī)制，為進(jìn)一步研究高脂飲食（或高脂血癥）對低氧環(huán)境人群肺組織的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 將體重180～200 g，6周齡清潔級雄性SD大鼠（由中國藥科大學(xué)提供）24只隨機(jī)分為3組（n＝8）：常氧（N）組（南京，海拔 10 m）、低氧（H）組（低壓氧艙，模擬海拔5 000m）、低氧聯(lián)合高脂飲食（H＋HFD）組（低壓氧艙，模擬海拔5 000m），低氧聯(lián)合高脂飲食組灌胃脂肪乳劑10 ml／（kg·d），每日一次，另外兩組灌服等體積的生理鹽水，普通飲食。于實(shí)驗(yàn)5周末取材，抽取大鼠外周靜脈血于EDTAK2抗凝管，留取肺組織于-80℃冰箱保存。

1.1.2 脂肪乳劑 參考文獻(xiàn)［11］方法制備脂肪乳劑：取豬油25 g放入200 ml燒杯內(nèi)，在磁力攪拌器上加熱至100℃，加入10 g膽固醇，溶化，再加入1 g丙基硫氧嘧啶，然后加入25 g吐溫80，充分?jǐn)噭颍瞥捎拖?。在另?00ml燒杯中加入30ml蒸餾水和20ml丙二醇，加熱至60℃，然后加入2 g脫氧膽酸鈉，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?，制成水相。然后將水相加入油相，充分混勻，即制成脂肪乳劑?/p>

1.1.3 主要儀器和試劑 低壓氧艙室（DYC-3000，貴州風(fēng)雷航空機(jī)械有限公司，體積：8 m×3 m×3 m），BC-2300全自動血細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子有限公司），ABI7500熒光實(shí)時定量儀（美國ABI公司），分光光度計(jì)（北京元業(yè)伯樂科技發(fā)展有限公司），DU800核酸蛋白儀（德國BECKMAN），冷凍離心機(jī)（德國BECKMAN），高速組織勻漿機(jī)（德國Miccra D-8）。一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物公司），血脂檢測試劑盒（北京利德曼生化股份有限公司），離心柱型-總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司），eNOS及β-actin一抗（美國Abcam公司），二抗（美國Santa Cruz Biotechnology lnc公司）。

1.2 方法

1.2.1 靜脈血血紅蛋白（Hb）濃度測定 使用 BC-2300全自動血細(xì)胞分析儀進(jìn)行靜脈全血Hb測定，嚴(yán)格按照儀器使用說明書進(jìn)行操作，檢測后采集數(shù)據(jù)。

1.2.2 血漿SOD活力和MDA含量測定 將抗凝血于3 000 r／min離心10 min，分離血漿，WST-1法測定 SOD活力，TBA比色法測定MDA含量。

1.2.3 血脂水平檢測 采用終點(diǎn)法檢測血漿總膽固醇（total cholesterol，TCH）及甘油三酯（triglyceride TG）含量，采用直接測定法檢測血漿高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）和低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）含量。試劑盒由北京利德曼生化股份有限公司提供，嚴(yán)格按照儀器及試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 肺組織硝酸鹽／亞硝酸鹽（NOx）水平檢測 采用硝酸還原酶法檢測肺組織硝酸鹽／亞硝酸鹽（NOx）水平，間接反映肺組織NO含量。

1.2.5 肺組織eNOSmRNA水平檢測 用離心柱法提取總RNA，按照TaKaRa FastQuant RT Kit說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，目的基 因 引 物 序 列：eNOS［12］上 游：5′-CTACCGGGACGAGGTACTGG-3′，下游：5′-GGAAAAGGCGGTGAGGACTT-3′，內(nèi)參基因引物序列：β-actin［11］上游：5′-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3′，下游：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTT-3′。Real-time PCR反應(yīng)體系（20μl體系）為：2×SYBR Select Master Mix 10μl，cDNA 2μl，上、下游引物各 0.4μl，滅菌雙蒸水 7.2μl。試驗(yàn)在ABI7500熒光實(shí)時定量PCR儀中進(jìn)行，每個樣品設(shè)3個重復(fù)孔，目的基因與內(nèi)參基因PCR反應(yīng)條件一致，Holding stage：50℃ 2min，95℃ 2 min；Cycling stage：95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)，ABIPrism 7500軟件采集和分析數(shù)據(jù)，采用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.6 肺組織eNOS蛋白水平檢測 將肺組織切成小塊，用蛋白裂解液裂解、勻漿、離心，取上清液用BCA蛋白分析試劑盒（Pierce Chemical Company，USA）測定樣品的總蛋白濃度。5×蛋白上樣緩沖液100℃變性5 min。采用12%SDS-PAGE分離蛋白，每泳道上樣量80μg。電泳后使用半干轉(zhuǎn)印槽（BioRad，USA）將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。經(jīng)5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h后，加入兔抗 eNOS（1：250），內(nèi)參加入兔抗βactin（1：1 000），4℃下孵育過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1：6 000），室溫孵育2 h，隨后使用ECL液進(jìn)行發(fā)光顯影，膠片掃描后，采用ImageJ軟件對凝膠圖像蛋白表達(dá)條帶積分光密度值進(jìn)行分析，計(jì)算目的（eNOS）條帶與內(nèi)參（β-actin）條帶積分光密度值的相對比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，應(yīng)用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 靜脈血Hb濃度測定

結(jié)果顯示 H組（244.50±14.17）g／L與 H＋HFD組（218.63±28.14）g／L大鼠靜脈血 Hb濃度明顯高于 N組（144.63±13.13）g／L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明低壓氧艙模擬5 000m海拔建造慢性重度低氧大鼠模型成功，模型可用于實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 血脂水平檢測

血脂檢測結(jié)果顯示H＋HFD組TCH、LDL含量明顯高于N組與H組；H組與H＋HFD組HDL含量明顯低于N組；三組間的TG水平無明顯差異（表1）。

Tab.1 Blood lipid changesof rats in two groups（mmol／L，ˉx±s，n＝8）

2.3 血漿MDA，SOD水平的測定

MDA含量檢測結(jié)果顯示，H組（23.29±2.56）nmol／mgprot與 H＋HFD組（28.88±1.71）nmol／mg prot大鼠靜脈血MDA含量明顯高于 N組（20.64±2.33）nmol／mg prot，H＋HFD組MDA含量明顯高于H組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SOD活力檢測結(jié)果顯示，與 N組（183.91±10.20）U／ml比較，H組（172.13±8.38）U／ml與 H＋HFD組（156.10±8.16）U／ml SOD活力明顯降低（P＜0.05）；與H組比較，H＋HFD組SOD活力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 肺組織NOx水平測定

NOx含量檢測結(jié)果顯示，H組（3.75±1.12）μmol／g prot與 H＋HFD組（1.66±0.14）μmol／g prot大鼠 NOx含量明顯低于 N組（8.20±1.57）μmol／g prot，（P＜0.05），H＋HFD組肺組織NOx含量明顯低于 H組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 肺組織eNOSmRNA水平測定

熒光實(shí)時定量檢測eNOSmRNA表達(dá)水平，采用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算，H組與H＋HFD組eNOSmRNA表達(dá)水平明顯低于N組，而與H組比較，H＋HFD組eNOSmRNA表達(dá)水平明顯降低（表 2）。

2.6 肺組織eNOS蛋白表達(dá)水平測定

eNOS蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果顯示，H組與H＋HFD組eNOS蛋白表達(dá)水平明顯低于N組（P＜0.05），而與H組比較，H＋HFD組 eNOS蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05，表2）。

Tab.2 Expression of eNOSmRNA and protein in lung of rats（ˉx±s，n＝5）

3 討論

本研究通過檢測肺組織eNOSmRNA與蛋白表達(dá)及NOx含量（間接反映NO含量），探討高脂飲食對慢性低氧SD大鼠肺組織eNOS／NO的影響及其機(jī)制。結(jié)果顯示，相對于常氧組與低氧組，低氧聯(lián)合高脂飲食組肺組織eNOSmRNA及蛋白表達(dá)水平、NOx含量明顯降低，血漿TCH及LDL水平、MDA含量明顯升高；低氧聯(lián)合高脂飲食組血漿SOD活力低于低氧組，表明高脂飲食進(jìn)一步降低了低氧環(huán)境大鼠肺組織eNOS／NO水平，減弱其對肺組織的保護(hù)作用。

低氧組大鼠肺組織NOx含量明顯低于常氧組，表明慢性重度低氧（低壓氧艙模擬海拔5000m）降低肺組織NOx含量，該結(jié)果與以往研究一致［14］。低氧聯(lián)合高脂飲食組肺組織NOx含量明顯低于低氧組，聯(lián)合因素使NO含量進(jìn)一步降低，減弱其對肺血管的保護(hù)作用，引起肺血管收縮，肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖，管壁增厚；同時影響血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，使其釋放的縮血管物質(zhì)增多，擴(kuò)血管物質(zhì)減少，進(jìn)而加重了肺動脈收縮與重構(gòu)，肺循環(huán)壓力升高，引起肺血管的損傷［15，16］，提示對于慢性重度低氧性肺組織損傷的患者，高脂血癥可能是其加重的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，應(yīng)予以預(yù)防和積極治療。

慢性重度低氧降低肺組織NOx水平，其原因可能是慢性重度低氧情況下產(chǎn)生的活性氧成分（ROS）增多，即表現(xiàn)為膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（MDA）增多，增加機(jī)體氧化壓力；而抗氧化能力降低，即抗氧化指標(biāo)SOD活力降低，引起機(jī)體氧化—抗氧化狀態(tài)失衡。一方面，氧化—抗氧化狀態(tài)失衡降低肺組織eNOS的mRNA及蛋白表達(dá)水平，減少eNOS催化底物產(chǎn)生的NO水平；另一方面，機(jī)體氧化壓力增高，產(chǎn)生的活性氧可直接清除NO，降低 NO的生物利用度及水平［17，18］，損傷血管內(nèi)皮，啟動肺血管疾病的發(fā)生和進(jìn)展［7］。本研究中，與低氧組相比，低氧聯(lián)合高脂飲食組大鼠血漿MDA含量明顯升高，SOD活力明顯降低，加重氧化—抗氧化狀態(tài)失衡；同時，低氧聯(lián)合高脂飲食組大鼠血漿LDL及TCH明顯高于低氧組，血脂異常不僅增加機(jī)體氧化壓力及eNOS脫偶聯(lián)［19］，還可通過誘導(dǎo)小窩蛋白，降低 eNOS與其從質(zhì)膜上解離，從而降低eNOS酶活性，即聯(lián)合高脂飲食因素使大鼠肺組織eNOS／NO水平進(jìn)一步降低。

綜上所述，本研究結(jié)果表明相對于單純低氧，聯(lián)合高脂飲食大鼠氧化應(yīng)激損傷加重，抗氧化能力降低，肺組織eNOS／NO損傷加重，提示長期高脂飲食可能是慢性重度低氧引起肺組織損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，氧化—抗氧化狀態(tài)失衡可能是其主要原因，應(yīng)積極干預(yù)和治療。在本研究中由于NO的半衰期短及實(shí)驗(yàn)條件限制，采用目前多數(shù)研究的方法，即通過測定NOx間接反映NO的含量，但NOx不能區(qū)分有生物活性的NO與被過氧化物清除的NO（硝酸鹽與亞硝酸鹽）；另外，本研究中如增設(shè)常氧高脂飲食組，更能揭示聯(lián)合因素的影響，但考慮到實(shí)驗(yàn)室所在地西寧海拔高度為2 260 m，不能滿足常氧條件，所以未設(shè)常氧高脂飲食組，我們會在以后的工作中盡量完善解決。

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