海洛因誘導CPP大鼠伏隔核腦電活動的無線遙測研究*

朱再滿，華田苗，周鴻銘，潘群皖，李 晶，李 敏

藥物成癮（drug addiction）是一種心理和身體依賴性的慢性復發(fā)性疾?。?］。目前認為藥物成癮的主要神經基礎是腦內獎賞系統(tǒng)，中腦腹側被蓋區(qū)（VTA）、伏隔核（NAc）、前額葉皮質（PFC）、底外側杏仁核（BLA）等構成的中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)，與藥物成癮密切相關［2］。Olds［3］提出的“VTA-NAc-PFC獎賞環(huán)路中，VTA及其投射區(qū)NAc是其主要的神經解剖結構，天然的獎賞性刺激都是通過作用于中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)，引起NAc內多巴胺（dopamine，DA）釋放增多而產生獎賞效應。故NAc是產生獎賞效應的關鍵核團，在阿片類藥物依賴形成機制中起著重要作用。

時間--頻率分析顯示，持續(xù)的新異刺激可導致人NAc腦電頻譜發(fā)生變化，以θ波、β波變化最為顯著［4］。麻醉和睡眠時相亦會影響大鼠NAc腦電活動頻率的分布［5］。藥物依賴個體NAc胞外腦電生理記錄研究較少，且方法僅為動物麻醉狀態(tài)的有線在體記錄，海洛因依賴個體清醒活動狀態(tài)NAc放電的無線遙測未見報道。本研究采用腦電無線遙測技術，結合條件性位置偏愛（conditioned place preference，CPP）系統(tǒng)，胞外記錄海洛因誘導CPP大鼠NAc腦電活動對海洛因的電生理反應性，探討其與大鼠位置偏愛及其覓藥行為之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料

成年清潔級SD大鼠（南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，合格證號：scxk蘇2007-0001）20只，體重290～320 g，雌雄不拘，常規(guī)飼養(yǎng)（室溫24℃±2℃，12 h光照，配備充足的嚙齒類飼料及飲用水）。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠NAc電極埋藏 1%戊巴比妥鈉腹腔注射（ip，50mg／kg體重），行雙側 NAc電極埋藏手術，術中篩選顱骨前囟至人字縫距離大于9 mm的大鼠做電極埋藏。根據(jù)Paxinos大鼠腦立體定位圖譜［6］，于顱骨表面（A：2.0mm，L：1.7mm，H：6.9mm）牙科鉆鉆孔，雙側置入鎳鉻絲電極。人字縫前兩側固定細螺桿，頭皮下組織埋藏接地電極，自凝牙科水泥固封。術后恢復5 d，前3天連續(xù)肌注40萬單位青霉素以防感染。實驗結束后，大鼠麻醉、取腦，作快速冷凍組織切片，檢查埋藏電極的位置，如位置偏離NAc則舍去所得數(shù)據(jù)。

1.2.2 海洛因誘導CPP大鼠模型制作、確認及海洛因戒斷 大鼠埋藏電極后，設置海洛因誘導組和對照組各10只，分別編號。實驗前將大鼠放入CPP系統(tǒng)黑白箱中自由習服，每天上午9∶00開始，持續(xù)45 min，連續(xù)3 d。習服結束后，做CPP測試，每只大鼠測試5次，每次15min，間隔1 h，觀察大鼠在CPP系統(tǒng)中的運動情況，用JLBehv條件性位置偏愛視頻分析系統(tǒng)（上海吉量軟件科技有限公司）記錄大鼠運動軌跡數(shù)據(jù)，統(tǒng)計每只大鼠黑、白箱中的停留時間、百分比及活動度。本實驗中大鼠普遍偏愛黑箱，故選白箱為伴藥箱，偏愛黑箱（在黑箱中平均停留時間超過540 s，即總時間900 s的60%以上）的大鼠進入下一階段實驗。

將海洛因誘導組大鼠趕至CPP系統(tǒng)白箱（伴藥箱）中給予海洛因（安徽省公安廳提供）SC，第1天總量0.5 mg／kg，以后每天注射 2次（AM 9∶00，PM 3∶00），每次均遞增 0.25 mg／kg。給藥后，將大鼠置于伴藥箱中45 min。自第2天開始，每天上午給藥前，測定海洛因誘導組CPP相關數(shù)據(jù)，每次15 min。對照組注射等體積生理鹽水，方法同海洛因誘導組。

大鼠連續(xù)注射藥物5 d后，每日將測得的大鼠伴藥箱停留時間與給藥前數(shù)據(jù)個體自身對照分析，伴藥箱停留時間超過給藥前50%為位置偏愛建模成功。

1.2.3 大鼠戒斷癥狀觀察 造模結束并完成即刻狀態(tài)NAc腦電記錄后，停止注射海洛因和NS，使大鼠進入自然戒斷狀態(tài)，觀察大鼠的戒斷癥狀。連續(xù)4 d，應用柳田知司評分標準［7］，對大鼠的戒斷癥狀進行評分。間斷咬牙及輕度煩躁各0.5分，觸碰激惹、間斷性意向性震顫、輕度流涎各1分，異常姿勢、靠近激惹、連續(xù)性意向性震顫、明顯流涎各2分，流淚、軟便各4分，腹瀉、大便不成形8分，體重減輕2%～4%為5分、減輕4%～6%為10分、減輕6%～8%為15分。計算每只大鼠戒斷癥狀的分值總和。

1.2.4 大鼠兩側NAc腦電活動的無線遙測 通過BW-200生理無線遙測系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），記錄各組大鼠兩側NAc的腦電活動。將微型無線遙測發(fā)射端子固定于大鼠背部，打開發(fā)射端子磁開關，輸入電極分別連接地電極和左、右側NAc埋藏電極，發(fā)射端子自動采集和發(fā)射NAc腦電活動活動，經智能接收機解碼，經網絡中心機輸送至電腦，利用系統(tǒng)服務軟件記錄和處理腦電信號。給藥前狀態(tài)為造模前大鼠于白箱中記錄，即刻狀態(tài)為CPP建模成功大鼠給藥10 min后白箱中記錄，戒斷狀態(tài)取CPP大鼠戒斷癥狀評分最高、戒斷癥狀明顯時記錄。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

大鼠CPP數(shù)據(jù)通過CPP系統(tǒng)軟件記錄，并繪制大鼠運行軌跡圖。NAc腦電活動遙測記錄和快速傅里葉分析通過BW-200無線遙測系統(tǒng)軟件完成，原始遙測腦電時間軸壓縮20倍，間隔隨機取樣，自動生成各頻率腦電百分比，腦電頻率為δ波（0.5～4）Hz，θ波（4～8）Hz，α1波（8～11）Hz，α2波（11～13）Hz，β1波（13～18）Hz，β2波（18～30）Hz，分段統(tǒng)計各頻率腦電百分比。所得數(shù)據(jù)用均值±標準差（ˉx±s）表示，采用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計分析，不同狀態(tài)下NAc腦電頻率比例顯著性檢驗用單因素方差（ANOVA）分析，并做方差齊性檢驗，兩兩比較用t檢驗。

2 結果

2.1 海洛因誘導大鼠白箱CPP的建立

習服后的大鼠分別做CPP測試，每只大鼠測試5次，每次15 min，記錄大鼠黑白箱停留時間及百分比，描繪運行軌跡。已編號的海洛因誘導組大鼠和對照組分別與實驗前比較，以白箱停留時間較給藥前大于50%為標準。結果顯示海洛因誘導組大鼠白箱給藥5 d后，部分大鼠即可產生CPP，給藥8 d后，大鼠白箱CPP顯著；部分大鼠10 d以后才出現(xiàn)。軌跡圖顯示CPP大鼠白箱中活動時間明顯延長，活動范圍增大（圖1），其中左箱為黑箱，右箱為白箱（伴藥箱）。本研究所采用的海洛因劑量能使所有模型組大鼠都產生依賴性，且未發(fā)生過量中毒死亡情況。對照組大鼠未出現(xiàn)白箱CPP。

Fig.1 Trajectory of rats in the CPP system A：Before drug；B：Four days after drug；C：Eight days after drug

2.2 海洛因誘導CPP大鼠戒斷癥狀評價分析

海洛因依賴建模之前，大鼠均未出現(xiàn)戒斷癥狀。建模成功后突然停止注射海洛因和NS，模型組大鼠出現(xiàn)煩躁不安、異常姿勢、意向性震顫、激惹、咬牙、流涎、流淚、腹瀉等戒斷癥狀；對照組未出現(xiàn)上述戒斷癥狀。戒斷第1～4天時，模型組大鼠戒斷癥狀評分明顯高于對照組（P＜0.01）。與建模前相比，模型組大鼠戒斷癥狀評分顯著增加（P＜0.01），其中戒斷第2天時戒斷癥狀最為顯著（表1）。大鼠海洛因戒斷癥狀評分比較的結果進一步證實了本實驗動物模型的可靠性。**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs beforemodeling

Tab.1 Evaluating on heroin withdrawal symptoms of rats（ˉx±s，n＝10）

2.3 海洛因誘導白箱CPP大鼠NAc腦電活動

2.3.1 大鼠NAc腦電活動腦電圖描記 在白箱中分別記錄海洛因誘導組大鼠NAc給藥前、給藥后即刻和藥物戒斷3個時期的自發(fā)腦電（圖2），每個腦電圖按時間軸壓縮20倍截選10 s。記錄的腦電圖波形穩(wěn)定，無干擾波，周期明顯。腦電圖顯示，給藥后即刻期腦電波（圖2B）頻率明顯低于給藥前期和戒斷期，且腦電波時程較長，波幅較大。

Fig.2 EEG of the NAc in different stages A：EEG recorded before drug；B：EEG recorded immediately after drug；C：EEG in withdrawal stage

2.3.2 大鼠NAc腦電活動頻率分析 記錄的NAc腦電經快速傅立葉變換后，獲取各頻段腦電百分比（圖3）。結果顯示，各期δ波百分比最大，α2波百分比最小，各期不同頻段腦電的分布梯度相同。大鼠即刻狀態(tài)NAc腦電發(fā)放較給藥前明顯變化，δ波比例顯著增大（P＜0.01），β1波、β2波比例顯著減小（P＜0.01）；戒斷狀態(tài)與給藥前比較，δ波比例增大（P＜0.05），α1波比例減?。≒＜0.01），其余頻段無顯著差異；即刻狀態(tài)較戒斷狀態(tài)δ波（P＜0.05）、α1波（P＜0.01）比例較大，β1波、β2波比例明顯較低（P＜0.01）；即刻狀態(tài)的δ波、β1波、β2波較其他狀態(tài)皆有顯著差異，其中δ波比例顯著增大，β1波、β2波比例顯著減?。≒＜0.01），即刻狀態(tài) NAc腦電總體趨勢是低頻腦電比例較大，高頻腦電比例較小。

Fig.3 Frequency spectrum of rat NAc EEG（ˉx±s，n＝10）*P＜0.05，**P＜0.01 vs immediately after drug； ＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs before drug；△P＜0.01 vs before drug

2.3.3 大鼠NAc腦電波幅 對無線遙測系統(tǒng)記錄的NAc自發(fā)腦電幅度進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，給藥前自發(fā)腦電平均波幅最小，且和其余各組差異顯著（P＜0.01），即刻狀態(tài)平均波幅較高，且明顯高于戒斷狀態(tài)（P＜0.01，圖 4）。

Fig.4 Wave amplitude of rat NAc EEG**P＜0.01 vs before drug；＃＃P＜0.01 vs immediately after drug

3 討論

腦內獎賞系統(tǒng)中，阿片類藥物通過增強NAc中DA能神經元的功能活動，引起NAc內DA釋放增加，亦可降低VTA中GABA能神經元活性，減弱其對NAc內DA能神經元的緊張性抑制，從而產生獎賞效應［8，9］。毀損伏隔核可減輕嗎啡依賴大鼠的戒斷癥狀和位置偏愛效應［10］，向伏隔核內注入阿片受體激動劑可使伏隔核內DA含量升高，并產生位置偏愛效應［11］，提示NAc是參與阿片類藥物依賴形成的重要核團，但藥物依賴不同時期內NAc神經元腦電活動的變化尚不清楚。

本實驗采用腦電無線遙測技術，觀察到大鼠在海洛因給藥前、即刻狀態(tài)、戒斷狀態(tài)的NAc腦電活動頻率分布及波幅存在差異，提示海洛因對大鼠NAc腦電活動形態(tài)會產生影響。本實驗采用的植入式無線遙測EEG記錄技術，最大優(yōu)勢在于可以同步監(jiān)測動物的EEG、活動度和行為學指標的變化，從而可以對EEG與行為進行同步研究，減少了動物受束縛的限制，可以使動物的應激狀態(tài)最小化，能更好地反映動物的真實狀態(tài)。植入式遙測EEG記錄技術減少了動物在急性和慢性研究中受金屬絲感染的機率，提高了EEG的質量，且持續(xù)記錄的可控性強，可從幾分鐘至幾個月，尤其適用于慢性動物實驗［12］。

本研究利用CPP系統(tǒng)，成功建立海洛因誘導CPP大鼠模型，因位置偏愛箱為相對封閉狀態(tài)，大鼠的行為數(shù)據(jù)皆可實時被記錄和分析，模型可信度較高。大鼠位置偏愛出現(xiàn)時間從5 d到10 d，顯示不同個體產生藥物依賴的差異性。各狀態(tài)腦電的頻率分布均呈現(xiàn)相同梯度，其中δ波比例皆最大，α2波比例皆最小，表明了腦電信號的相對穩(wěn)定性。有報道認為大鼠急性給予嗎啡后，嗎啡依賴組大鼠伏隔核放電平均頻率降至2 Hz甚至2 Hz以下［13］，與本研究中大鼠給藥后即刻期δ波比例較給藥前顯著升高（達45.58%）的結果一致，表明給藥后有較多的NAc神經元出現(xiàn)同步化活動，與慢波睡眠期大鼠NAc的腦電活動特征相似［5］。戒斷期的β2、β2波比例與給藥后即刻期有顯著差異，即低頻腦電波比例減少，而高頻腦電波比例又出現(xiàn)回升，并與給藥前的無顯著差異，提示海洛因戒斷期大鼠伏隔核神經元活動的去同步化增強。因此，NAc神經元活動的同步化程度可能與海洛因依賴具相關性，這種同步化活動是否與NAc內DA或GABA遞質系統(tǒng)的調節(jié)有關有待后續(xù)進一步研究。

治療藥物成癮和依賴是當前醫(yī)學界面臨的一大難題。本研究發(fā)現(xiàn)，海洛因依賴伏隔核神經元放電形式、頻率發(fā)生了改變，表明海洛因依賴對大鼠伏隔核神經元活動有影響。有形態(tài)學研究表明，電鏡下海洛因依賴大鼠伏隔核神經元可見變性、凋亡，海洛因依賴可使伏隔核神經元超微結構發(fā)生變化［14］。海洛因依賴對腦內獎賞系統(tǒng)的相關遞質的表達可能也有影響，尤其是VTA-NAc-PFC環(huán)路中相關遞質的表達有待進一步研究。鑒于NAc在藥物依賴中的重要作用，有研究用伏隔核毀損術毀損伏隔核的核心部以抑制大鼠海洛因自我給藥的建立［15，16］，并有顯著的效果。但因靶點毀損是不可逆的，伏隔核本身又與自然獎賞等人類本能行為密切相關，毀損后的心理學改變及長期影響亦需要研究。所以，我們擬借鑒電針對海洛因成癮大鼠的行為干預［17］及腦深部電刺激（deep brain stimulation，DBS）在治療癲癇［18］、帕金森癥［19］等疾病中的應用，利用 NAc植入電極電刺激回輸技術，探索治療藥物依賴的新途徑。

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