E 4031對慢性心衰大鼠離體心臟功能和心肌細(xì)胞內(nèi)靜息Ca2＋水平的影響*

白曉潔，郝峻濤，封啟龍

（1.山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系細(xì)胞生理學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原030001；2.山西省人民醫(yī)院胸外科，太原030012）

在慢性心力衰竭的病理發(fā)展過程中，心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2＋穩(wěn)態(tài)破壞是關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，不僅直接影響著心肌細(xì)胞的收縮舒張功能，而且會引發(fā)一系列Ca2＋依賴的信號通路異常，導(dǎo)致心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能改變。因此，糾正細(xì)胞內(nèi)Ca2＋失衡是心衰治療的策略之一［2，3］。E 4031是一種Ⅲ類抗心律失常藥物，其機(jī)制主要被認(rèn)為是選擇性抑制Ik快速激活成分（Ikr），延長動作電位時(shí)程。近年來我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)除Ikr外，E 4031還可以激動心肌細(xì)胞膜鈉鈣交換體（sodium calcium exchanger，NCX），增強(qiáng)其內(nèi)向和外向電流［1］。NCX是心肌細(xì)胞膜上的雙向離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，介導(dǎo)Na＋和Ca2＋的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，對于心肌細(xì)胞內(nèi)Na＋和Ca2＋穩(wěn)態(tài)的維持具有重要的作用。E 4031具有激動NCX電流的作用，那么它是否會通過影響心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2＋水平而影響心臟功能？目前還未見相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)選用大鼠為實(shí)驗(yàn)動物（心肌細(xì)胞膜表面幾乎不表達(dá)Ikr），通過縮窄腹主動脈建立慢性心衰模型，利用激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)和Langendorff離體心臟灌流觀察E 4031對慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)靜息Ca2＋水平和心功能的影響，并對其作用機(jī)制和臨床意義進(jìn)行初步探討，旨在為臨床心衰治療靶點(diǎn)的選擇提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備和實(shí)驗(yàn)分組

本實(shí)驗(yàn)采用成年雄性Wistar大鼠（150～200 g，山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供），正常組不進(jìn)行手術(shù)處理；模型組采用腹主動脈縮窄建立大鼠慢性心力衰竭模型：10%水合氯醛（0.3ml／100 g體重）腹腔注射麻醉，腹正中切口，于左腎動脈分叉處上方分離腹主動脈，將腹主動脈與7號注射器針頭共同結(jié)扎（4-0號絲線），抽出針頭，使該部位動脈形成狹窄。偽手術(shù)組不用絲線結(jié)扎腹主動脈，其余操作步驟同模型組。術(shù)后每只大鼠肌肉注射青霉素5×104U／d連續(xù)7 d。模型組動物分為對照組和E 4031組，對照組指直接對模型制備成功的動物進(jìn)行指標(biāo)檢測，E 4031組指對模型組動物離體心臟和分離細(xì)胞進(jìn)行藥物干預(yù)后，再進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.2 主要試劑和儀器

E 4031、Fluo-3／AM、HEPES購自美國 Sigma公司，其余為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

臺氏液成分（mmol／L）：NaCl 140，KCl 5.4，NaH2PO40.33，HEPES 5.0，葡萄糖 10.0，MgCl21.0，CaCl21.8，用 NaOH調(diào) pH值至 7.4。

Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)（AD Instruments）；RM6240多道生理信號采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠）；蠕動泵（YZ1515，保定蘭格恒流泵有限公司）；激光共聚焦顯微鏡（Olympus）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Langendorff離體心臟灌流檢測心功能 采用Langendorff離體心臟灌流法，檢測各組大鼠心功能及E 4031對模型組血流動力學(xué)指標(biāo)的影響，具體操作步驟參見文獻(xiàn)［4］。E 4031組動物在離體心臟臺氏液灌流穩(wěn)定后，轉(zhuǎn)用含 E 4031（10μmol／L）的灌流液繼續(xù)灌流5 min。分別在用E4031前后檢測以下指標(biāo)：左室發(fā)展壓（LVDP）、左室收縮最大速率（＋dp／dtmax）、左室舒張最大速率（-dp／dtmax）等。

1.3.2 大鼠心室肌細(xì)胞急性分離 采用Langendorff離體心臟灌流裝置，利用酶解法急性分離心衰大鼠心肌細(xì)胞，具體操作步驟參見已發(fā)表文獻(xiàn)［5］。

1.3.3 激光共聚焦顯微鏡檢測心肌細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度變化 將各組心肌細(xì)胞與鈣熒光指示劑fluo3／AM共同孵育10～15 min后以臺氏液沖洗殘余染料。選取橫紋清晰，桿狀，表面干凈平整，無自發(fā)收縮的細(xì)胞置于倒置共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的載物臺上進(jìn)行連續(xù)動態(tài)掃描，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度變化可指示細(xì)胞內(nèi)游離Ca2＋離子濃度的變化。E 4031組指在模型大鼠心肌細(xì)胞平皿中加入 E 4031（10μmol／L），觀察藥物對細(xì)胞內(nèi)游離Ca2＋離子濃度的影響［6］。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，統(tǒng)計(jì)處理用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，各組采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，并用Newman-Keuls檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠離體心功能檢測

與正常組和偽手術(shù)組相比，模型組離體心臟左室發(fā)展壓（LVDP）、左室收縮／舒張最大速率（±dp／dtmax）明顯降低（P＜0.05，表 1），表明模型制備成功。模型組動物給予 E 4031（10μmol／L）繼續(xù)灌流后，血流動力學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)較對照組均有明顯提高（P＜0.05，表 1，圖 1）。

Tab.1 Hemodynamic indexesof rathearts（LV）in differentgroups（ˉx±s，n＝10）

Fig.1 Effects of E 4031 to isolated heart function of rats with chronic heart failure（ˉx±s，n＝5）LVDP：Left ventricular developed pressure； ±dP／dtmax：Maximal rise／fall velocity of left ventricular pressure*P＜0.05 vs control

2.2 各組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度檢測

與正常組和偽手術(shù)組相比，模型對照組心室肌細(xì)胞靜息鈣熒光強(qiáng)度明顯升高（P＜0.05，圖2）。E 4031組心室肌細(xì)胞內(nèi)靜息鈣熒光強(qiáng)度值首先呈現(xiàn)短期先升后降過程，然后在較低的水平保持穩(wěn)定（P＜0.05，圖 2）。

Fig.2 Effects of E 4031 on fluoresence intensity of intracellular free calcium in ratswith chronic heart failure

3 討論

在長期的高壓力負(fù)荷下，心肌細(xì)胞會依次經(jīng)歷代償性肥大和失代償性衰竭過程，最終導(dǎo)致心臟收縮力下降，組織器官灌注不足，嚴(yán)重者會影響到生命。在其病理生理機(jī)制研究中，心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2＋紊亂及其穩(wěn)態(tài)的糾正一直是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一［2，3］。

E 4031是九十年代出現(xiàn)的一類Ⅲ型抗心律失常藥物，研究表明，E 4031的抗心律失常作用與其抑制心肌細(xì)胞膜延遲整流鉀電流（Ik），增加有效不應(yīng)期（effective refractory period，ERP）時(shí)間，延長動作電位時(shí)程有關(guān)。除抗心律失常效應(yīng)外，E 4031還具有增強(qiáng)心肌細(xì)胞收縮力的作用［7］，這種強(qiáng)心作用最早被認(rèn)為是動作電位時(shí)程延長后，增加了平臺期Ca2＋內(nèi)流所致。2000年本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，E 4031對大鼠心室肌細(xì)胞NCX的正向和反向電流，均有明顯的激活效應(yīng)［1］。2002年本實(shí)驗(yàn)室又報(bào)道了盡管大鼠心肌細(xì)胞缺乏Ik通道，E 4031仍然具有增加Ca2＋瞬變和細(xì)胞收縮的作用，并證實(shí)這種效應(yīng)與E 4031刺激反向NCX有關(guān)，在肥大心肌細(xì)胞效果更為明顯［8］。

NCX表達(dá)和功能增強(qiáng)對于肥大或衰竭心肌細(xì)胞而言是利是弊存在爭論，不同研究結(jié)論不同［9，10］。在我們的實(shí)驗(yàn)中，由于大鼠心肌細(xì)胞缺乏Ik通道，使得 E 4031的作用機(jī)制主要以激動 NCX為主。NCX轉(zhuǎn)運(yùn)方式具有雙向性，取決于心肌細(xì)胞內(nèi)外Na＋和Ca2＋的跨膜梯度及細(xì)胞膜電位，這種特性也成為其調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)的前提和基礎(chǔ)，同時(shí)也決定了激動NCX對心肌細(xì)胞的收縮和舒張功能都有增強(qiáng)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，與正常心肌細(xì)胞相比，壓力負(fù)荷性心衰大鼠心功能降低，E 4031可以使衰竭心臟各項(xiàng)血流動力學(xué)指標(biāo)LVDP、±dp／dtmax均顯著增強(qiáng)。

心肌肥大／心衰時(shí)，心肌細(xì)胞 Ca2＋調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)和功能發(fā)生改變，造成胞內(nèi)Ca2＋穩(wěn)態(tài)失衡。細(xì)胞膜兩側(cè)Na＋和Ca2＋跨膜梯度的改變?yōu)镹CX轉(zhuǎn)運(yùn)提供了驅(qū)動動力，并決定其轉(zhuǎn)運(yùn)模式，最終的目的是趨向恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)外正常的離子平衡狀態(tài)。在我們的實(shí)驗(yàn)中，E 4031與模型組大鼠心肌細(xì)胞共孵育后，首先引起細(xì)胞內(nèi)Ca2＋短暫升高，然后很快下降，并保持在較低水平。這種結(jié)果可能與NCX的作用模式有關(guān)，心衰時(shí)細(xì)胞內(nèi)Na＋濃度升高［9］，增加了反向NCX模式的驅(qū)動力，使得NCX功能增強(qiáng)后首先使細(xì)胞內(nèi)靜息Ca2＋水平上升，加重心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2＋超載。但是NCX也是心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2＋泵出的主要途徑，細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度增高對正向NCX模式同樣會有促進(jìn)作用，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度的下降。正是NCX的這種雙向調(diào)節(jié)模式，最終使衰竭的心肌細(xì)胞內(nèi)離子水平，特別是Na＋和Ca2＋水平趨于穩(wěn)定，對衰竭心臟功能的維持具有一定的支持意義。Gotz Munch等人的研究結(jié)果也表明，心衰家兔短期（2周）在體鈉鈣交換體過表達(dá)，對心肌細(xì)胞的收縮功能有一定的損害，但是長期（6周）在體鈉鈣交換體過表達(dá)，卻可以降低心肌細(xì)胞收縮和舒張功能的損害進(jìn)程［9］。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們分析，E 4031對于衰竭離體大鼠心臟功能的增強(qiáng)作用，一方面可能與其增強(qiáng)心肌細(xì)胞鈣瞬變的峰值和上升下降速率有關(guān)［8］，同時(shí)，E 4031對于衰竭心肌細(xì)胞內(nèi)靜息Ca2＋水平的維持以及各種Ca2＋依賴的下游活動的相對穩(wěn)定，也可能是保持甚至恢復(fù)心肌細(xì)胞功能狀態(tài)的原因，這些推論有待于深入的實(shí)驗(yàn)研究。

現(xiàn)有的很多研究認(rèn)為，心衰發(fā)展過程中NCX的表達(dá)上調(diào)與心肌肥大／心衰的發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)，抑制其活動可以有利于阻止或延緩疾病的進(jìn)程。但是也有實(shí)驗(yàn)提示過度抑制NCX表達(dá)同樣會導(dǎo)致心肌重塑，乃至心衰的發(fā)生［10］。這些結(jié)果表明，在病理刺激-心肌肥大-心衰的發(fā)生發(fā)展過程中，鈉鈣交換體的作用是值得我們進(jìn)一步深入研究的，單純抑制NCX，對心衰后心臟的功能而言，不一定是最佳選擇。通過我們的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在衰竭的心肌細(xì)胞，NCX活性增強(qiáng)，最初確實(shí)會加劇細(xì)胞內(nèi)Ca2＋超載，但是后期會使細(xì)胞內(nèi)Ca2＋趨于穩(wěn)定，并保持在相對正常的水平，同時(shí)心臟功能也有一定程度的恢復(fù)。所以，NCX在心衰發(fā)展過程中的作用和意義是有利有弊的，這也許是以 NCX為干預(yù)靶點(diǎn)研究的“瓶頸”，今后我們的研究方向可能需要圍繞體內(nèi)NCX調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)及多靶點(diǎn)治療，以恢復(fù)或糾正NCX的表達(dá)和功能為目標(biāo)，而不是簡單的抑制或激動。

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