長期運動對幼齡大鼠下丘腦腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的影響*

焦廣發(fā)，高 峰，王海英，劉 徽，謝永濤，何玉秀△

（1.河北體育學院運動人體科學系，石家莊050041，2.河北師范大學體育學院，石家莊050041）

運動與攝食活動之間的關(guān)系復雜，一般認為中等強度的運動可刺激攝食活動，以補充運動中消耗的能量從而維持體重［1］。下丘腦是機體能量平衡和攝食調(diào)控的中樞，分泌的神經(jīng)肽和神經(jīng)因子參與運動對攝食活動的調(diào)節(jié)。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）在神經(jīng)元的生長、分化、成熟過程中發(fā)揮重要作用，近年來發(fā)現(xiàn)BDNF對攝食活動具有中樞性的調(diào)控作用，BDNF可引起體重下降和攝食減少，因此BDNF也是一種抑食欲因子。BDNF首先合成前體 BDNF（precursor of brain derived neurotrophic factor，pro-BDNF），經(jīng)細胞外的水解酶剪切成為成熟的BDNF。研究表明，腦內(nèi)BDNF和pro-BDNF受生長發(fā)育調(diào)節(jié)，在大鼠幼齡期變化較為顯著［2］。短期的運動可使正常體重大鼠和肥胖大鼠海馬內(nèi)BDNF升高［3］。因此，下丘腦中的 BDNF可能在幼齡大鼠攝食活動中發(fā)揮重要的作用。目前，有關(guān)幼齡大鼠在發(fā)育過程中進行長期運動下丘腦內(nèi)BDNF系統(tǒng)的變化和作用機制尚不清楚，為此進行本項工作。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

清潔級10周齡SD大鼠（河北省動物實驗中心，許可證編號 SCXK冀2008-1-003），按前期方案制備孕鼠［6］，選取3周齡斷乳雄性幼鼠進行實驗。幼鼠用清潔自來水和國家標準大鼠飼料飼養(yǎng)（河北省動物實驗中心提供），自由飲水攝食。飼料由河北省動物實驗中心提供。實驗室內(nèi)濕度控制在50%±5%，溫度控制在（23±2）℃，自然光照。幼鼠隨機分為對照組（C）和運動組（E），每組各6只。C組安靜不運動，E組每天運動一次。

1.2 運動方案

游泳運動方案采用無負重游泳運動，最初每次30 min，每周增加15min，運動量增加到60min后每周增加5min，第9周達到每次90 min。大鼠每天運動1次，每周運動6 d，共9周。

1.3 取材

大鼠取材前空腹8 h，停止運動48 h。腹腔注射0.5%的戊巴比妥鈉（50mg／kg）麻醉，心臟取血，制備血清，-20℃保存?zhèn)溆?。分離下丘腦，沿正中線分為兩半放入液氮，-80℃保存。

1.4 血清BDNF測試

血清BDNF采用ELISA法，Wellscan MK2型酶標儀測試，美國Millipore試劑盒。

1.5 下丘腦組織BDNFmRNA測試

取右側(cè)下丘腦組織提取總RNA，進行完整性分析和含量后，使用Fermentas公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit）進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42℃60 min，70℃ 5min。

引物由上海invitrgoen公司合成。按Takara公司RT-PCR試劑盒（SYBR Premix Ex Taq）配制PCR擴增反應(yīng)體系，使用Applied Biosystems（ABI 7000）定量PCR儀擴增。擴增反應(yīng)條件：95℃，10 s，1 Cycle；95℃，5 s，60℃，30 s，40 Cycle。目的基因和引物序列以及擴增產(chǎn)物量：BDNF上游引物：GTTCCACCAGGTGAGAAGGG，下 游 引 物：GCCTTCATGCAACCGAAGTAT，擴增產(chǎn)物量 75 bp；GAPDH上游引物 CAAGGTCATCCATGACAACTTTG， 下 游 引 物 GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG，擴增產(chǎn)物量496 bp。

1.6 下丘腦組織BDNF蛋白測試

取左側(cè)下丘腦組織，液氮研磨，加入裂解液12 000 r／min 4℃離心 10 min。BCA法測定蛋白濃度。加入 5×loading buffer 100℃煮沸5 min變性。取30μg蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至NC膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉30 min。分別用 BDNF和 pro-BDNF（4℃，兔多抗，1：100，美國 Santa Cruz公司），GAPDH（4℃，兔多抗，1：10 000）孵育過夜。TBST洗膜3min×5次。二抗室溫孵育（羊抗兔-HRP，1：2 000）40 min。TBST洗膜TBST洗膜3 min×5次，加入ECL發(fā)光液，暗室曝光。UVP凝膠成像系統(tǒng)掃描膠片，以目的蛋白條帶灰度值除以相應(yīng)內(nèi)參蛋白GAPDH條帶灰度值得出最終結(jié)果。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示，統(tǒng)計處理用SPSS 11.5軟件進行分析。Real-time PCR結(jié)果比較使用Wilcoxon非參數(shù)檢驗，其他指標不同組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 實驗大鼠運動第1周、第9周攝食量、總攝食量以及體重變化

C組和E組大鼠在實驗開始時體重無統(tǒng)計學差異，12周齡時E組大鼠體重低于C組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩組大鼠在運動第1周和第9周每周攝食量無統(tǒng)計學差異，同時實驗期間9周總攝食量也無統(tǒng)計學差異（表1）。

2.2 12周齡大鼠血清BDNF含量以及下丘腦組織BDNF mRNA和蛋白表達水平

E組和C組大鼠血清BDNF含量和下丘腦BDNFmRNA無統(tǒng)計學差異，但下丘腦組織pro-BDNF和BDNF蛋白表達水平E組和C組具有統(tǒng)計學差異，E組均高于C組（P＜0.05，表 2，圖 1）。

3 討論

本實驗觀察到幼齡大鼠在長期運動后體重較低，但在運動的開始階段、運動的最后階段以及整個運動期間大鼠的攝食量沒有變化，說明本實驗運動方案使幼齡大鼠維持了攝食活動的穩(wěn)定。Broom等［4］報道跑臺運動后食欲受到抑制，饑餓感不明顯。盡管游泳運動可以改變食欲，但在人體的實驗研究中并沒有發(fā)現(xiàn)攝食量的真正增多。運動引起食欲減退現(xiàn)象一般出現(xiàn)在大強度運動后，兒童在急性的運動后攝食也會減少［5］。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠進行轉(zhuǎn)輪運動可以增加能量支出和食物攝入［6］。本研究結(jié)果提示幼齡大鼠長期運動仍維持正常的攝食活動，并不因運動出現(xiàn)攝食的增多或減少。

Tab.1 BW at3 week-old and 12 week-old and at the first and the ninth exercise week and total FIof rats（g，ˉx±s，n＝6）

Tab.2 Serum BDNF，BDNFmRNA，BDNF and pro-BDNF protein in hypothalamus of rats（ˉx±s，n＝6）

Fig.1 Expression level of pro-BDNF and BDNF protein in hypothalamus of rats by Western blot C：Control group；E：Exercise group；pro-BDNF：Precursor of brain derived neurotrophic factor；BDNF：Brain derived neurotrophic factor；GAPDH：Reference genes

近年來的研究揭示能量支出和食物攝入控制系統(tǒng)的復雜性，負責能量平衡的神經(jīng)內(nèi)分泌活動發(fā)揮關(guān)鍵作用。一次遞增負荷運動后下丘腦弓狀核中主要的神經(jīng)遞質(zhì)變化與運動應(yīng)激有關(guān)，而6周運動后神經(jīng)遞質(zhì)的變化會產(chǎn)生適應(yīng)［7］。這說明長期運動使下丘腦功能產(chǎn)生穩(wěn)定性的變化。Rothman等［8］認為BDNF是能量代謝神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和行為活動之間的整合因子。本研究中幼齡期長期運動大鼠下丘腦BDNFmRNA表達水平?jīng)]有變化，但pro-BDNF和成熟的BDNF蛋白表達水平均升高。

成熟的BDNF與pro-BDNF都具有生物學活性，但生物學活性作用存在差異，Pro-BDNF與成熟的BDNF功能和作用完全相反，并且BDNF的不足或不平衡導致精神及行為的改變［9］。因此，本研究中長期運動大鼠在實驗期間內(nèi)攝食活動沒有變化與BDNF和pro-BDNF同時升高有關(guān)，推測長期運動引起B(yǎng)DNF升高的食抑制食欲作用與pro-BDNF升高產(chǎn)生的促食欲作用相互抵消。轉(zhuǎn)輪運動可以引起大鼠腦內(nèi)多個區(qū)域BDNF在轉(zhuǎn)錄水平上的表達，但BDNF的轉(zhuǎn)錄水平升高只發(fā)生在運動后幾分鐘到幾小時內(nèi)［10］。結(jié)合本研究中 BDNFmRNA的變化，說明長期運動更可能影響幼齡大鼠下丘腦內(nèi)BDNF由mRNA向蛋白翻譯的過程。

本研究中幼齡期長期運動大鼠血清BDNF沒有發(fā)生顯著變化。在中等強度運動后即刻血清BNDF可出現(xiàn)暫時的升高，在高強度的運動和力竭運動后的研究也發(fā)現(xiàn)，血清中BDNF出現(xiàn)一段時間的升高。但運動后血清中BDNF升高保持的時間較短，在運動停止后會迅速返回到基礎(chǔ)水平，推測運動對安靜狀態(tài)下血清中BDNF含量影響較小。

綜上，長期運動使幼齡大鼠下丘腦BDNF和pro-BDNF蛋白表達水平同時升高。