白藜蘆醇在大鼠離體心臟低溫保存中的保護(hù)作用及其機(jī)制*

孫瑋明，鄭鳴之，應(yīng) 磊，虞曉明，吳斯文，陳瑩瑩，沈岳良，汪 洋△

白藜蘆醇（resveratrol，RES）是蒽醌萜類化合物，主要來(lái)自蓼科植物虎杖的根莖提取物，也存在于各種物種如桑葚、花生、堅(jiān)果、漿果等，在葡萄皮中的含量很豐富。許多研究證實(shí)，RES在心臟保護(hù)中起到重要作用［1］。RES像其他多酚類物質(zhì)一樣，能刺激很多相同的細(xì)胞內(nèi)通路，是目前發(fā)現(xiàn)最好的沉默信息調(diào)節(jié)因子蛋白1（silent information regulator protein-1，Sirt-1）的激活劑［2］。Sirt-1是一種 NAD＋依賴的蛋白去乙?；?，在心衰、心肌缺血／再灌注和糖尿病心臟病中的保護(hù)作用也已得到很多研究的肯定［3］。本研究采用離體大鼠心臟低溫保存模型，觀察RES對(duì)長(zhǎng)時(shí)程低溫保存心臟的心肌細(xì)胞保護(hù)作用，和對(duì)Sirt-1表達(dá)的影響，為臨床有效改善供體心臟保存條件提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體重200～250 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（浙）2010-0150。

1.2 主要試劑

（1）一抗（Sirt-1抗體、β-action抗體）購(gòu)于 abcam。RES、NAM購(gòu)于Sigma。RIPA裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）購(gòu)自Millipore。二喹林甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒和化學(xué)發(fā)光底物（SuperSignal West Pico enhanced-chemiluminescent substrate，ECL）均購(gòu)自Pierce。RES使用前用二甲基亞砜（DMSO）溶解，DMSO的終濃度始終小于0.1%。（2）Celsior液用于心臟的停搏與保存，其成分及含量為：（單位：mmol／L）NaOH 100、KCl 15、MgCl213、CaCl20.25、mannitor 60、lactobionate 80、histidine 30、glutamate 20，pH 7.4，滲透壓 320mOsm／L。

1.3 動(dòng)物分組及心臟低溫保存模型的制備

1.3.1 動(dòng)物分組 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為以下 7組（n＝6）：空白對(duì)照組（control）：大鼠離體心臟快速取出后留標(biāo)本檢測(cè)；單純Celsior低溫保存組（9 h）：大鼠離體心臟置于單純 Celsior液（4℃）中保存 9 h；RES組（3、10、30μmol／L RES）：大鼠離體心臟在含 3、10、30μmol／L RES的 Celsior液中保存 9 h；尼克酰胺組（NAM）：大鼠離體心臟在含 40μmol／L Sirt-1抑制劑尼克酰胺（NAM）的 Celsior液中保存9 h；白藜蘆醇＋尼克酰胺組（RES＋NAM）：大鼠離體心臟在含 30μmol／L RES和 40μmol／L NAM的 Celsior液中保存9 h。

1.3.2 離體心臟 Langendorff灌流與低溫保存模型制備 SD大鼠術(shù)前禁食過(guò)夜，自由飲水。頸椎脫臼后將大鼠背位固定切開腹腔，迅速開胸剪去胸廓，暴露心臟及大血管，剪斷肺靜脈，迅速取出心臟。置于4℃KH液中除去血液，然后迅速轉(zhuǎn)移并固定于Langendorff灌注裝置上，用改良KH液行常規(guī)逆行恒壓灌注（76mmHg），改良 KH液組成成分（單位：mmol／L）：NaCl 118.9、KCl 4.69、CaCl22.2、MgSO41.17、KH2PO41.17、NaHCO317.9、EDTA 0.03、Glucose 9.99，pH7.4。整個(gè)灌注期間溫度保持在 37℃，灌注液用95%O2、5%CO2飽和。KH液平衡灌注30 min后，改用4℃的 Celsior液灌注，灌注時(shí)間控制在 3 min以內(nèi)，此時(shí)心臟表面同時(shí)降溫，待心臟停搏后，各組心臟在4℃條件下不同Celsior心肌保存液中分別保存9 h后取出，以備指標(biāo)檢測(cè)用。

1.4 HE染色光鏡觀察

用HE染色方法光鏡下觀察心肌細(xì)胞在各組中的形態(tài)學(xué)變化。切取左室心尖部全層心肌，用4%的多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察心肌細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)改變、心肌纖維等，并拍片。

1.5 RT-PCR檢測(cè)Sirt-1的基因表達(dá)

用Trizol法提取標(biāo)本總RNA，根據(jù)操作流程用thmero逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。用2%的瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物。引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系如下：cDNA 1μl，上下游引物各1μl，2×TaqPCR MasterMix 12.5μl，補(bǔ)去離子水至終體積25μl。按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增：預(yù)變性，94℃ 3 min；PCR反應(yīng)，94℃ 1 min；退火 1 min 30 s；延伸：72℃5min。循環(huán)次數(shù)和退火溫度：Sirt-1 35個(gè)循環(huán)，58.6℃。

Tab.1Sequences for primers

1.6 Western blot檢測(cè)Sirt-1的蛋白表達(dá)

標(biāo)本置于 RIPA裂解液（1%PMSF）中，冰上裂解、勻漿，4℃離心后取上清。蛋白濃度測(cè)定采用BCA法。取 30μg蛋白上樣，10%SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加Sirt-1一抗（1：500），4℃孵育過(guò)夜 16～18 h，次日洗滌后加二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（1：10 000），室溫?fù)u晃1 h。洗滌后暗室內(nèi)ECL反應(yīng)，曝光、顯影、定影。應(yīng)用數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)拍照，將目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參照β-actin的灰度值做比較，計(jì)算相對(duì)灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 低溫保存后心肌細(xì)胞的變化

HE染色觀察低溫保存后各組心肌細(xì)胞。對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核居中（圖1A）；9 h組心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞皺縮變形，細(xì)胞核邊集，間隙增寬（圖1B）；與9 h組相比，隨著RES濃度的增加，RES處理組（3、10、30μmol／L RES組）心肌細(xì)胞損傷得到明顯的改善，以30μmol／L組最為明顯，心肌細(xì)胞排列逐漸接近正常，界限清晰，胞漿豐富均勻（圖 1B、1C、1D、1E）；與 9 h組相比，NAM組心肌細(xì)胞排列不整，細(xì)胞壞死崩解，輪廓消失（圖 1F）；與 30μmol／L RES組相比，RES＋NAM組可見(jiàn)細(xì)胞排列不整，界限不清，細(xì)胞間隙增大（圖1G）。

Fig.1 HE staining for morphological changes of cardiomyocytes with the lightmicroscope（HE×200）A：Control group；B：9 h group；C：3μmol／L RES group；D：10μmol／L RES group；E：30μmol／L RES group；F：NAM group；G：RES＋NAM group；Res：Resveratrol；NAM：Niacinamide

2.2 各組Sirt-1基因表達(dá)情況

對(duì)照組心肌組織胞漿中Sirt-1mRNA表達(dá)明顯，9 h組表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01）。與9 h組相比，隨著RES濃度的增加，3、10、30μmol／L RES組 Sirt-1 mRNA表達(dá)逐漸升高（P＜0.05）。與 9 h組相比，NAM組 Sirt-1 mRNA表達(dá)下降（P＜0.05）。與 30 μmol／L RES組相比，RES＋NAM組 Sirt-1 mRNA表達(dá)降低（P＜0.01，圖 2，表2）。

2.3 各組Sirt-1蛋白表達(dá)情況

對(duì)照組心肌組織胞漿中Sirt-1蛋白表達(dá)明顯，9 h組表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01）。與9 h組相比，隨著RES濃度的增加，3、10、30μmol／L RES組 Sirt-1蛋白表達(dá)逐漸升高（P＜0.05）。與9 h組相比，NAM組Sirt-1蛋白表達(dá)下降（P＜0.01）。與 30μmol／L RES組相比，RES＋NAM組Sirt-1蛋白表達(dá)降低（P＜0.01，圖 3，表 2）。

Fig.2 Changes in Sirt-1mRNA expression in hypothermic preserved rat hearts（ˉx±s，n＝6）NAM：Niacinamide；Res：Resveratrol；Sirt-1：Silent information regulator protein-1

Fig.3 Changes in Sirt-1 protein expression in hypothermic preserved rathearts（ˉx±s，n＝6）NAM：Niacinamide；Res：Resveratrol；Sirt-1：Silent information regulator protein-1

Tab.2 Expression of Sirt-1 mRNA and Sirt-1 protein in myocardial tissue of eac group（ˉx±s，n＝6）

3 討論

在心臟移植術(shù)中，減輕供體心臟的低溫保存損傷是手術(shù)成功的前提。心臟長(zhǎng)時(shí)程低溫保存后，可使心肌細(xì)胞缺血、缺氧，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生腫脹變性，最終發(fā)生凋亡和壞死，而致心功能減退直至功能不全，可嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。心肌細(xì)胞的壽命和狀態(tài)關(guān)系到心臟移植的效果，因此，最大限度地減少心肌細(xì)胞的損傷具有重要的意義。提高心臟保存質(zhì)量，延長(zhǎng)心臟的有效保存時(shí)間是心臟移植領(lǐng)域一個(gè)有待解決的重要問(wèn)題，迫切需要尋找增強(qiáng)心肌保護(hù)和延長(zhǎng)心臟低溫保存時(shí)間的藥物。若在保存液中能添加有效藥物，減輕長(zhǎng)時(shí)程低溫保存引起的細(xì)胞損傷，為器官的低溫保存提供新的藥物作用靶點(diǎn)，這對(duì)提高心臟移植過(guò)程中對(duì)供體心臟保存的效果具重大意義［4，5］。

RES的生物活性相當(dāng)廣泛，包括抗氧化、抗炎、抗癌、抗凋亡、抗動(dòng)脈硬化、抗衰老、抗胰島素抵抗等很多作用［6-8］。研究表明，RES對(duì)于乳鼠心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用［9］。本實(shí)驗(yàn)保存液中添加RES的目的是為了改善低溫缺血缺氧環(huán)境下心肌細(xì)胞的損傷。本實(shí)驗(yàn)HE染色結(jié)果可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，9 h組心肌細(xì)胞損傷明顯，表明長(zhǎng)時(shí)程低溫保存對(duì)大鼠心臟損傷明顯。在保存液中添加RES后，可明顯改善低溫保存9 h后大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的損傷，同時(shí)觀察到Sirt-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高。RES的這種保護(hù)作用可被Sirt-1的抑制劑NAM所取消，提示在心臟長(zhǎng)期缺血缺氧低溫保存過(guò)程中RES通過(guò)Sir-1發(fā)揮保護(hù)作用。

研究證實(shí)，RES的保護(hù)作用與激活Sirt-1有密切關(guān)系［10］。RES在糖尿病的心臟病的治療中、顯著減輕大鼠心肌缺血／再灌注損傷及改善心衰等許多作用都可能是通過(guò)激活Sirt-1途徑發(fā)揮作用的。Sirt-1對(duì)心臟的保護(hù)作用［11］，可對(duì)防止心臟肥大、代謝失調(diào)、炎癥和對(duì)抗缺血／再灌注損傷、減輕氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡等方面均起重要作用。RES對(duì)Sirt-1的激活，Sirt-1的高表達(dá)能減少心肌細(xì)胞的凋亡、壞死［12］。Sirt-1在基因沉默、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、延長(zhǎng)細(xì)胞壽命等方面都具有非常重要的作用，這些機(jī)制可能參與長(zhǎng)期心肌保存的有益作用［13，14］。

RES直接加到保存液中進(jìn)行心臟保存研究有很大的臨床可行性。本研究結(jié)果可見(jiàn)，RES與心肌保存液共存9 h明顯減輕了低溫缺血缺氧所致的細(xì)胞損傷。RES可能通過(guò)調(diào)節(jié)Sirt-1表達(dá)，對(duì)抗長(zhǎng)時(shí)程低溫保存缺血缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞變形變性，保證了心肌細(xì)胞的長(zhǎng)期存活。供心低溫保存時(shí)間的延長(zhǎng)和保存效果的改善，為遠(yuǎn)距離獲取供心提供了有利的保證，將擴(kuò)大臨床供心的來(lái)源，挽救更多終末期心臟病人，為糖尿病合并心臟病患者提供一種新的治療方法。

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