富硒大豆多肽對高脂致大鼠脂肪肝和抗氧化功能的影響*

王鳳杰，陳顯兵，張書毓，譚志鑫，向國敏，劉錦紅

流行病學(xué)調(diào)查顯示隨著人們生活水平的提高，脂肪肝的發(fā)病率逐年上升，近年研究表明，脂肪肝患者體內(nèi)活性氧聚集，而且肝組織氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)會嚴(yán)重危害機(jī)體的肝功能［1］。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種分子伴侶蛋白，在氧化應(yīng)激時大量表達(dá)以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定，被看作是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的標(biāo)志性蛋白［2］，有研究顯示ERS信號通路及其效應(yīng)與非酒精性脂肪肝病關(guān)系密切［3］。因此本實(shí)驗(yàn)從營養(yǎng)干預(yù)角度研究富硒大豆多肽對脂肪肝大鼠肝組織酶活性及自由基代謝的影響及可能機(jī)制，為臨床疾病的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物、主要試劑和儀器

富硒大豆多肽粉由實(shí)驗(yàn)室自制［4］，其中測出硒含量 13.031mg／kg。膽固醇（武漢化學(xué)試劑公司）；豬油、雞蛋自備。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malonyldialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；離心機(jī)（德國eppendorf 5418型）；UV-5300紫外可見分光光度計(jì)和冰凍切片機(jī)（德國徠卡1850uv）；兔抗大鼠GRP78（美國Bioword公司）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔（中杉金橋）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組

Wistar大鼠40只，由湖北省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，雌雄各半，體重150～180 g，常規(guī)喂養(yǎng)1周后分為4組：（n＝10），正常對照組（NC）喂標(biāo)準(zhǔn)飼料（由湖北民族學(xué)院動物房提供）、灌喂同體積的生理鹽水；高脂模型組（HC）喂高脂飼料（在標(biāo)準(zhǔn)飼料中添加膽固醇2%、豬油10%和雞蛋5%）、灌喂同體積的生理鹽水；高硒組（SeN）喂標(biāo)準(zhǔn)飼料及富硒大豆多肽水溶液（100mg／kg bw）；富硒大豆多肽組（SeH）喂高脂飼料，富硒大豆多肽水溶液（100mg／kg bw）。按上述要求持續(xù)喂養(yǎng)10周。

1.3 觀察指標(biāo)及測定分析方法

1.3.1 一般情況變化 處死前禁食24 h，下腔靜脈采血及分離取出肝臟標(biāo)本備用，并計(jì)算體重、肝重及肝指數(shù)（肝臟濕重／體重），分析各指標(biāo)變化。

1.3.2 肝臟組織病理學(xué)檢查 肝臟分別取材：（1）10%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色觀察肝臟脂肪變性、炎細(xì)胞浸潤及纖維化程度。（2）蘇丹Ⅲ染色：肝組織冰凍切片，片厚6μm，70%酒精固定2min，放入蘇丹Ⅲ酒精溶液中染色25 min，70%酒精洗去多余的染料、水洗，蘇木素復(fù)染3 min，1%鹽酸酒精分化、水洗，藍(lán)化，甘油封固。脂肪呈橘黃色或者紅色。光鏡下評估脂肪變性程度［5］。（3）免疫組織化學(xué)染色：采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化法（SP）法，DAB顯色，一抗GRP78的工作濃度為 1：100，操作流程按試劑說明書進(jìn)行。GRP78表達(dá)程度判斷標(biāo)準(zhǔn)：＋：肝小葉內(nèi)約有1／3以下細(xì)胞陽性染色，著色為淺黃色；＋＋：肝小葉內(nèi)約有2／3細(xì)胞陽性染色，著色為棕黃色或棕色；＋＋＋：肝小葉內(nèi)約有2／3以上細(xì)胞陽性染色，著色為棕褐色或深棕色［6］。

1.3.3 血清和肝勻漿GSH-Px、MDA和 SOD測定（1）取血測定血清中 GSH-Px、MDA和 SOD含量；（2）取-80℃凍存肝組織約1 g，在冰浴中用EDTA-PBS緩沖液（PH 7.4）制成 10%的勻漿，離心，取上清測GSH-Px、MDA和SOD含量。測定方法均按試劑盒說明書操作，GSH-Px、MDA和SOD測定分別采用二硫代二硝基苯甲酸法（DTNB法）、硫代巴比妥酸法（TBA法）和亞硝酸鹽法。

1.3.4 血脂和肝功能檢測 用全自動生化分析儀檢測大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三脂（triglycerides，TG）的水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，結(jié)果用單因素方差分析和 t檢驗(yàn)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重、肝重及肝指數(shù)的變化

HC組大鼠體重、肝重及肝指數(shù)均明顯高于NC組，富硒大豆多肽干預(yù)后各指數(shù)均降低（P＜0.05）。NC與 SeN組各指標(biāo)無明顯差異（P＜0.05，表1）。

Tab.1 Changes of body weight，liver weight and liver index of the four groups（ˉx±s，n＝10）

2.2 肝臟組織病理學(xué)變化

常規(guī)HE染色證實(shí)NC及SeN兩組大鼠肝臟無明顯肝細(xì)胞脂肪變性；HC組見肝小葉內(nèi)多數(shù)肝細(xì)胞胞漿疏松呈空泡狀，小葉中央?yún)^(qū)可見肝細(xì)胞水腫，部分區(qū)可見散在點(diǎn)灶狀壞死及炎細(xì)胞浸潤，但無明顯纖維組織增生，說明高脂模型組大鼠肝臟出現(xiàn)明顯脂肪變性；SeH組肝細(xì)胞內(nèi)空泡數(shù)量明顯減少，炎細(xì)胞浸潤程度改善。

蘇丹Ⅲ染色，NC及SeN兩組大鼠肝細(xì)胞漿內(nèi)無明顯紅色脂滴；HC組見彌漫性紅色脂滴，大部分肝細(xì)胞內(nèi)擠滿了紅色的微小脂滴；SeH組肝內(nèi)脂滴數(shù)量明顯減少（圖1見彩圖頁Ⅱ）。隨機(jī)選取五個高倍視野計(jì)數(shù)每100個肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴陽性細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖2，顯示高脂組肝臟內(nèi)明顯脂肪變性，干預(yù)后脂肪肝病變程度減輕。

2.3 肝臟GRP78表達(dá)情況

GRP78表達(dá)定位于肝細(xì)胞胞漿，NC及SeN組的表達(dá)不明顯，散在分布，無明顯差異；HC組內(nèi)可見GRP78表達(dá)呈彌漫性分布，分布范圍與肝細(xì)胞脂肪變性的分布范圍較一致，SeH組大鼠肝內(nèi)GRP78表達(dá)較HC組明顯減弱（圖3見彩圖頁Ⅱ）。隨機(jī)選取五個高倍視野計(jì)數(shù)每100個肝細(xì)胞中GRP78表達(dá)細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖4。

Fig.2 Number of positive cells（ˉx±s，n＝10）NC：Normal group；HC：Model group；SeN：Control group；SeH：Experimental group**P＜0.01 vs NC；＃P＜0.05 vs HC

Fig.4 Number of GRP78 positive in 100 cells（ˉx±s，n＝10）NC：Normal group；HC：Model group；SeN：Control group；SeH：Experimental group**P＜0.01 vs NC；＃＃P＜0.01 vs HC

2.4 大鼠血清和肝勻漿中GSH-Px、SOD和MDA的變化

2.4.1 血清中各指標(biāo)變化 HC組血清中SOD和GSH-Px活性均較NC組明顯降低，MDA含量增高，而模型組灌喂富硒大豆多肽后，SOD、GSH-Px活性提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），證實(shí)富硒干預(yù)后大鼠血中抗氧化酶活性增高，但MDA含量仍高于NC組，可能是大鼠血液內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)指標(biāo)仍高于正常。SeN與NC組相比無明顯差異（表2）。

2.4.2 肝勻漿中各指標(biāo)變化 HC組大鼠肝勻漿組織中SOD和GSH-Px活性均較NC組明顯降低，MDA含量增高，而且干預(yù)后SOD、GSH-Px活性提高，MDA含量下降，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明富硒干預(yù)后肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)明顯減輕（P＜0.01，表3）。

Tab.2 Level of GSH-Px、SOD and MDA in serum of rats（ˉx±s，n＝10）

Tab.3 Level of GSH-Px、SOD and MDA in liver of rats（ˉx±s，n＝10）

2.5 各組大鼠血脂和肝功能變化

HC組血清中 ALT、AST、TC及 TG均明顯高于NC和SeN組，干預(yù)后SeH組各指標(biāo)均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明富硒大豆多肽干預(yù)后肝功能及血脂水平均得到明顯改善（表4）。

Tab.4 Changes of liver function and blood lipid of four groups（ˉx±s，n＝10）

3 討論

有研究證實(shí)脂肪肝的發(fā)病機(jī)制與脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激密切相關(guān)［7］，而高脂飼料可誘導(dǎo)大鼠肝臟細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)［8］，高糖高脂膳食喂養(yǎng)后大鼠血中甘油三酯、膽固醇及低密度脂蛋白的濃度均明顯增加［9］，因此本實(shí)驗(yàn)選用高脂飲食誘導(dǎo)大鼠脂肪肝模型，結(jié)果顯示脂肪肝組大鼠肝重及肝指數(shù)均明顯高于正常組，血脂（TC，TG）及血清 ALT，AST均較正常組增高，另外病理組織學(xué)顯示脂肪肝組大鼠肝臟脂肪變性明顯，小葉內(nèi)灶性炎細(xì)胞浸潤，證明造模成功。高脂模型組大鼠血清及肝勻漿內(nèi)SOD，GSHPx含量均低于正常組，MDA含量顯著高于正常組，說明肝內(nèi)抗氧化反應(yīng)酶活性降低，同時脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，提示氧應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)可能參與脂肪肝的發(fā)生。

細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激可以破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)和誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是脂肪酸代謝的第一場所，同時發(fā)現(xiàn)脂肪酸在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)代謝會產(chǎn)生一定量的活性氧（ROS），氧化應(yīng)激能啟動鈣從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣池的釋放，導(dǎo)致線粒體內(nèi)鈣積聚，這進(jìn)一步增加了活性氧的產(chǎn)生，放大氧化應(yīng)激及鈣負(fù)載，引起惡性循環(huán)。GRP78是ERS的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)增加能維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定［10］，引導(dǎo)蛋白質(zhì)正確折疊，改善細(xì)胞生理狀態(tài)，起到暫時保護(hù)細(xì)胞、延緩炎細(xì)胞浸潤等作用［11］，我們實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)高脂飲食引起的NAFLD肝臟GRP78表達(dá)增加，提示高脂飲食誘導(dǎo)了肝ERS。富硒大豆多肽干預(yù)可以提高大鼠血清及肝勻漿中GSH-Px、SOD活性和降低MDA含量，尤其是降低肝組織內(nèi)的MDA含量作用更加明顯，從而糾正體內(nèi)氧化抗氧化失衡狀態(tài)，改善肝臟脂肪變性和炎細(xì)胞浸潤程度，降低了肝內(nèi)GRP78表達(dá)，減輕由氧化應(yīng)激引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，對脂肪肝的發(fā)展有一定的干預(yù)作用。

田金可等報(bào)道硒具有抗氧化功能［12］，程天德證實(shí)富硒大豆低聚肽的抗氧化能力比亞硒酸鈉強(qiáng)［13］，研究證實(shí)微量元素硒通過GSH-Px表現(xiàn)其生物學(xué)功能，且硒能直接或和SOD一起清除氧自由基，使動物TC、TG顯著降低，升高HDL-C。陳美珍等研究了大豆酶解產(chǎn)物、大豆多肽、大豆低聚肽的抗氧化活性［14］，因此大豆多肽本身含有多種抗氧化的活性肽，具有降低血清LDL膽固醇、促進(jìn)脂肪代謝、有效清除自由基［15］等作用，富硒大豆多肽干預(yù)可提高肝組織內(nèi)抗氧化酶活性，清除自由基，可能與硒的作用有關(guān)，也可能與大豆多肽本身的抗氧化作用密切相關(guān)。

本研究證實(shí)富硒大豆多肽能增強(qiáng)大鼠脂肪肝的肝臟抗氧化能力，干預(yù)脂肪肝的發(fā)生發(fā)展，其作用機(jī)制可能與提高體內(nèi)抗氧化酶活性，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低肝臟內(nèi)GRP78的表達(dá)有關(guān)。有關(guān)脂肪肝發(fā)生過程中富硒大豆多肽是通過哪種途徑來減輕肝損傷和提高抗氧化作用的問題，有待于我們進(jìn)一步研究。

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