有氧運動對原發(fā)性高血壓大鼠的降壓作用及對骨骼肌VEGF、eNOS表達的影響*

馬志勇，趙永才

（唐山師范學院體育系，河北唐山063000）

高血壓是危害人類健康的疾病之一，易引發(fā)心腦血管疾病，目前仍以藥物治療為主，近年來非藥物治療受到重視。運動療法具有良好治療效果，而且國內外較多研究證實規(guī)律的有氧運動可降低高血壓患者血壓，減少并發(fā)癥的發(fā)生，降低對藥物的依賴，改善患者的生活質量［1，2］。但運動降低血壓的分子機制相對來說研究較少，運動療法降低血壓通過哪些途徑，相關機制還不清楚。

高血壓與血管的生長和通暢有關，而血管內皮生長因子（endothelialgrowth factor，VEGF）與血管生長調節(jié)有關，是高血壓疾病研究的熱點。VEGF能特異性地作用于血管內皮細胞，是血管內皮細胞特異的有絲分裂素，具有增加微靜脈、小靜脈通透性，促進血管內皮細胞分裂、增殖以及誘導血管形成等作用［3］。肌肉大量毛細血管生成受多種因素影響，常規(guī)體力活動可以保持和維持機體骨骼肌毛細血管的水平，運動可以促進毛細血管密度的提高，這一過程與血管剪切力增加、肌纖維牽拉、能量代謝增加及肌肉氧分壓改變有關系，這些研究在鍛煉群體上已得到驗證［4］。另外骨骼肌是血液重要儲存器官，其毛細管數量多少和通暢性將會直接影響到血壓的高低，因此骨骼肌中VEGF及其受體（endothelial growth factor receptor，VEGFR）等血管生長調節(jié)因子會影響到骨骼肌毛細血管的生長，進而影響血壓。研究［5］發(fā)現在骨骼肌靜置萎縮模型中，骨骼肌毛細血管密度下降，而通過血管緊張素的治療發(fā)現骨骼肌毛細血管密度得以維持，同時VEGF及VEGFR的含量和毛細血管密度保持正向關聯。因此有必要研究運動對骨骼肌VEGF、內皮型一氧化氮合酶（endothelial NO synthase，eNOS）等血管調節(jié)因子的影響，這對了解運動治療高血壓的內在機制具有重要意義。本研究考察游泳運動訓練對高血壓大鼠血壓、骨骼肌VEGF、VEGFR、eNOS等因子的影響，分析血壓變化與肌肉血管調節(jié)因子的聯系，探索運動降壓分子調節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象及分組

3個月齡雄性原發(fā)性高血壓（spontaneous hypertensive rat，SHR）大鼠14只（北京維通利華有限公司提供，SPF級，280 g左右），隨機分為2組（n＝7）：高血壓對照組（SHR-C），高血壓運動訓練組（SHR-T）；同樣月齡正常血壓（WKY）大鼠7只作為正常血壓對照組（WKY-C），分籠飼養(yǎng)，室溫 20℃～25℃，濕度40%～60%，自然光照，自由飲食，定期消毒滅菌。

1.2 運動方式

SHR-T大鼠在自制泳池中先進行1周適應性訓練，然后進行10周無負重游泳訓練，每周訓練5 d，每天運動1次，第1周每次運動40 min，第2周50 min，第3周增加到60 min后保持不變，直至訓練完畢，WKY-C、SHR-C組不運動。SHR-T訓練結束24 h后三組大鼠引頸處死，提取比目魚肌，液氮速凍后冷凍保存，進行后續(xù)PCR和免疫印跡等測定。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 血壓和脈搏檢測方法 實驗大鼠清醒狀態(tài)下，使用無創(chuàng)傷鼠尾加壓阻斷法測量大鼠安靜收縮壓（systolic blood pressure，SBP），以鼠尾光電容積脈搏波隨尾套壓力下降而重新出現作為收縮壓的檢測信號，檢測嚴格按照RBP-1型大鼠血壓計說明書進行。運動方案開始前一周大鼠熟悉血壓檢測環(huán)境和儀器，訓練開始前及結束后下午5點所有大鼠測壓1次，同時記錄心率（heart rate，HR）。

1.3.2 免疫印跡法分析 VEGF、VEGFR2和 eNOS的表達 使用提取的冷凍肌組織提取總蛋白，稱取適量肌組織后加入含有PMSF的RIPA裂解液（碧云天生物科技研究所提供），用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解，然后低溫14 000×g離心5 min。按常規(guī)操作提取蛋白并上樣，其常規(guī)程序為：6%～15%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白；將帶有目的條帶的凝膠進行濕轉，一抗：VEGF（1∶500）、VEGFR2（1∶500）、eNOS（1∶1 000），VEGF、VEGFR2一抗（北京博奧森生物公司），eNOS一抗（CST公司）；4℃過夜孵育后洗膜，二抗室溫孵育1 h，TBST再洗膜，最后化學發(fā)光液孵育印跡膜，凝膠成像系統(tǒng)半定量分析測得的灰度值，GAPDH表達量作為參照進行結果校正。

1.3.3 RT-PCR檢測 VEGFmRNA的含量 取 100 mg肌組織加入 1 ml Trizol（Invitrogen公司）提取總RNA，嚴格按照RNA提取試劑盒要求操作，通過檢測RNA樣品 A260／A280的比值，確定 RNA的純度。VEGF引物序列，上游：5-GGCTCACTTCCAGAAACACG-3，下游：5-GTGCTCTTGCAGAATCTAGTGG-3，引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。實時熒光定量PCR采用SYBR Green染料法，PCR反應總體積為25μl，包括 2μl反轉錄產物，12.5μl SYBR Green Master Mix，2μl目的基因引物和 8.5μl滅菌三蒸水，以β-actin基因為內參，以2-ΔΔCt計算 mRNA相對表達值。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 運動訓練前后各組大鼠血壓、心率的變化

訓練前各組血壓有差異，具體為SHR-C、SHR-T大鼠血壓高于WKY-C大鼠血壓，具有非常顯著性差異（P＜0.01）；而 SHR-C、SHR-T兩組由原發(fā)性高血壓大鼠隨機分組，血壓無顯著性差異（P＞0.05）；運動訓練對SHR-T組血壓產生影響，SHR-T組血壓無論是與運動前自身還是與運動后SHR-C組比較，血壓均顯著性降低（P＜0.05）；運動訓練前各組心率無顯著性差異（P＞0.05），訓練后 SHR-T組心率與運動前自身、運動后SHR-C、WKY-C比較均顯著性降低（P＜0.01，表 1）。

Tab.1 Changes of blood pressure and heart rate before and after training（ˉx±s，n＝7）

2.2 運動訓練后各組大鼠VEGF mRNA的表達結果

RT-PCR結果以WKY-C為對照組，以WKY-C相對值為1，對比各組大鼠實驗后骨骼肌VEGFmRNA表達的差異，WKY-C和SHR-C兩組大鼠VEGFmRNA（1.00±0.20，0.92±0.11）無顯著性差異，本次實驗檢測沒有發(fā)現高血壓大鼠VEGFmRNA的異常，其表達只有低于WKY-C組的趨勢，但SHR-T組的VEGFmRNA表達（1.23±0.16）顯著性高于 WKY-C、SHR-C組（P＜0.05，圖 1）。

Fig.1 VEGFmRNA expression in different groups after exercise training VEGF：Vascular endothelial growth factor；WKY-C：NormotensiveWistar-kyoto control；SHR-C：Spontanoushypertensive rats control；SHR-T：Spontanous hypertensive rats training*P＜0.05 vs WKY-C；＃P＜0.05 vs SHR-C

2.3 運動訓練后各組大鼠 VEGF、VEGFR2、eNOS蛋白表達結果

免疫印跡測定發(fā)現各組 VEGF、VEGFR2、eNOS蛋白表達不同，SHR-C組VEGF顯著性低于WKY-C組（P＜0.05），表明原發(fā)性高血壓大鼠肌肉VEGF先天低于正常血壓大鼠，而SHR-T組經過運動訓練后VEGF表達雖然還低于WKY-C組，但卻顯著性高于SHR-C組（P＜0.05），表明運動訓練能夠提高 VEGF表達；WKY-C組和SHR-C組VEGFR2表達無顯著差異，但經過訓練后SHR-T組VEGFR2表達顯著高于前兩組（P＜0.05）；SHR-C組 eNOS表達顯著性低于WKY-C（P＜0.05），但 SHR-T組訓練后 eNOS表達高于 SHR-C組，有非常顯著性差異（P＜0.01，表 2）。

Tab.2 Expressions of VEGF、VEGFR2 and eNOS in different groups（ˉx±s，n＝7）

3 討論

3.1 運動訓練前后不同組別大鼠血壓、心率的差異

原發(fā)性高血壓以藥物治療為主，但易產生依賴。體育運動，具有良好降壓效果。有氧運動降低患者血壓的研究較多，大多數研究采用有大量肌群參與的長時間動力性運動，如健走、慢跑、游泳以及中國傳統(tǒng)體育項目，發(fā)現具有良好效果［6，7］。研究發(fā)現訓練前SHR-C組和SHR-T組血壓顯著性高于WKYC組（P＜0.01），表明本研究高血壓大鼠模型符合研究要求。SHR-T組訓練后血壓明顯低于SHR-C組和自身訓練前水平（P＜0.05），表明本研究的游泳訓練對高血壓大鼠產生良好效果，能有效降低大鼠血壓。本研究和以前高血壓動物實驗模型研究結果類似，張陵［8］研究發(fā)現游泳訓練使SHR大鼠血漿腎上腺髓質素顯著性增加，且血壓降低，認為運動訓練可增加腎上腺髓質素，進而舒張血管，降低血壓。另一篇研究［9］也發(fā)現SHR大鼠大鼠進行運動訓練能改善血漿前列環(huán)素／血栓烷平衡，降低血壓及血栓形成。由此可見，有氧運動能夠降低原發(fā)性高血壓大鼠血壓。另外本研究發(fā)現3個組大鼠安靜心率無顯著性差異，SHR-T組訓練后心率顯著性低于SHR-C組和訓練前自身（P＜0.01），也顯著性低于WKY-C組（P＜0.01），表明有氧訓練對心血管機能產生良好適應，安靜心率降低和血壓下降同步發(fā)生，安靜心率降低可能與心肺耐力水平增加有關，心率下降是心血管系統(tǒng)適應的結果。

3.2 運動訓練后不同組別大鼠VEGF、VEGFR2及eNOS的差異

關于高血壓的形成認為和外周器官骨骼肌有一定關系，認為這類人群先天或后天缺乏體力活動等因素易引起血管過度收縮，導致部分微動脈阻塞，進而引起毛細血管充盈不足，容易引發(fā)毛細管密度減少和微循環(huán)障礙等問題［10，11］。VEGF屬于生血管因子，VEGF通過與血管內皮相應受體結合促進內皮細胞增殖，同時可增加血管通透性使內皮細胞遷移，誘導血管生成，是目前認為最強烈的血管生成因子［3］。另外 eNOS廣泛分布于存在于血管內皮細胞、血小板、腎小管上皮細胞等細胞中，通過催化L-精氨酸產生NO，在心血管系統(tǒng)中，具有維持血管正常舒張功能，促進血管內皮細胞損傷、修復及抑制血小板聚集等功能［12］，降低eNOS基因表達，易出現血管內皮損傷和血壓升高［13］。

目前認為肌肉血管生長與VEGF、VEGFR2及eNOS有密切關系，認為eNOS能夠刺激VEGF產生，促進血管內皮細胞生長并對抗凋亡［14］。還有研究發(fā)現在成年小鼠組織器官中敲除基因或抑制VEGF表達，能顯著性降低組織毛細血管密度并提高凋亡水平［15］。另外VEGF促進血管生長的途徑與VEGFR2關系最為密切，兩者結合能引起內皮細胞生長和遷移［16］，并且研究發(fā)現VEGF和VEGFR2結合主要通過PI3K信號途徑和其下游Akt信號分子傳導信號，進一步刺激eNOS基因的表達，從而引起血管再生和抗凋亡作用［17］。

本研究沒有發(fā)現SHR-C組VEGFmRNA異常，其表達有低于 WKY-C組的趨勢，但 SHR-T組的VEGFmRNA表達明顯高于WKY-C、SHR-C組，說明基礎狀態(tài)下高血壓大鼠VEGFmRNA表達和正常大鼠水平相當，而經過運動訓練能顯著提升高血壓大鼠VEGFmRNA表達，這為加速VEGF蛋白合成奠定了基礎。而對于各組VEGF蛋白的測定卻發(fā)現和VEGFmRNA并不完全一致，首先SHR-C組VEGF顯著性低于WKY-C組，表明雖然VEGFmRNA表達兩組無顯著差異，但高血壓大鼠VEGF蛋白卻明顯偏低，表明高血壓大鼠VEGFmRNA轉錄后蛋白翻譯水平受到限制，VEGF蛋白過低限制了血管的生長，這也可能是原發(fā)性高血壓大鼠高血壓形成的一個原因。另外運動訓練后SHR-T組VEGF蛋白顯著提升，表明運動能有效促進VEGF的合成，這也是降壓的機制之一。本研究和前人的研究結果相似，宋海霞［18］等人發(fā)現跑臺訓練同樣促進了大鼠股四頭肌VEGF蛋白顯著提高，認為VEGF表達提高對促進血管生長、減少肌肉缺血有積極作用。結合本研究可發(fā)現無論高血壓疾病模型還是健康個體，有氧耐力運動均可提高 VEGF的表達。SHR-T組訓練后VEGFR2、eNOS相比SHR-C組同步升高，而且還明顯高于WKY-C組，這表明VEGFR2和eNOS對運動訓練更敏感。

國內研究發(fā)現適量運動可以促進大鼠心肌VEGF的表達，毛細血管面積比增加，但大負荷運動對心肌有損害，抑制VEGF的表達［19］。而國外研究也發(fā)現長期運動鍛煉可上調老年大鼠心肌和骨骼肌VEGFmRNA和蛋白水平，增加毛細血管密度，對抗因衰老而造成心血管調節(jié)信號途徑的減弱［20，21］。結合本研究，可認為運動訓練可促進肌肉血管生成因子表達，有利于血管生成。毛細血管密度提高能改善外周血循環(huán)效率，可能是運動降壓的原因之一。本研究沒有檢測毛細血管密度，是不足之處，運動降壓機制還需繼續(xù)研究。

綜上所述，原發(fā)性高血壓大鼠血壓高于對照組，骨骼肌VEGF、eNOS蛋白低于對照組；有氧運動訓練能明顯降低原發(fā)性高血壓大鼠的血壓，促進骨骼肌VEGFmRNA、VEGFR2、eNOS等蛋白表達，血管生長因子水平增加有利于血管生成，可能是運動降壓的一個機制。

［1］ Amaral SL，Zorn TM，Michelini LC.Exercise training normalizes wall-to-lumen ratio of the gracilis muscle arterioles and reduces pressure in spontaneously hypertensive rats［J］.JHypertens，2000，18（11）：1563-1572.

［2］ Melo RM，Martinho E Jr，Michelini LC.Training-induced，pressure-lowering effect in SHR：wide effects on circulatory profile of exercised and nonexercisedmuscles［J］.Hypertens，2003，42（4）：851-857.

［3］ Rissanen TT，Vajanto I，Hiltunen MO，et al.Expression of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor-2（KDR／FLK-1）in ischemic skeletal muscle and its regeneration［J］.Am J Patbol，2002，160（4）：1393-1403.

［4］ Egginton S.Invited review：activity-induced angiogenesis［J］.Pflugers Arch，2009，457（5）：963-977.

［5］ 周 越，蘇 晴.血管緊張素II對廢用性骨骼肌萎縮毛細血管重塑的影響［J］.體育科學，2011，31（7）：67-72.

［6］ 王曉軍，荊治坤，鄭寧寧.不同太極拳運動強度防治原發(fā)性高血壓病干預效果的研究［J］.沈陽體育學院學報，2011，30（4）：82-85.

［7］ 陳香仙，呂慧青.太極拳運動對高血壓患者血漿NO濃度及RBC膜鈉、鈣泵酶活性的影響［J］.北京體育大學學報，2006，29（10）：1359-1361.

［8］ 張 陵，張 鈞.運動對高血壓大鼠ADM影響的研究［J］.中國體育科技，2007，43（6）：115-117.

［9］ 竇 麗，張 鈞.有氧運動對高血壓大鼠血壓和血漿PGI2／TXA2系統(tǒng)的影響［J］.西安體育學院學報，2008，25（2）：76-78.

［10］Levy BI，Ambrosio G，Pries AR，et al.Microcirculation in hypertension：a new target for treatment［J］.Circulat，2001，104（6）：735-740.

［11］Feihl F，Liaudet L，Waeber B，etal.Hypertension：a disease of the microcirculation［J］.Hypertens，2006，48（6）：1012-1017.

［12］ Huang PL.eNOS，metabolic syndrome and cardiovascular disease［J］.Trends Endocrinol Metab，2009，20（6）：295-302.

［13］Mahn K，Borrás C，Knock GA，etal.Dietary soy isoflavone induced increases in antioxidant and eNOS gene expression lead to improved endothelial function and reduced blood pressure in vivo［J］.FASEB J，2005，19（12）：1755-1757.

［14］Byrne AM，Bouchier-Hayes DJ，Harmey JH.Angiogenic and cell survival functions of vascular endothelial growth factor（VEGF）［J］.JCellMolMed，2005，9（4）：777-794.

［15］Tang K，Breen EC，Gerber HP，et al.Capillary regression in vascular endothelial growth factor-deficient skeletalmuscle［J］.Physiol Genomics，2004，18（1）：63-69.

［16］Wang H，Olszewski B，RoseburyW，etal.Impaired angiogenesis in SHR is associated with decreased KDR and MT1-MMP expression［J］.Biochem Biophys Res Comm，2004，315（2）：363-368.

［17］Gerber HP，McMurtrey A，Kowalski J，et al.Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3’-kinase／Akt signal transduction pathway：requirement for Flk-1／KDR activation［J］.JBiol Chem，1998，273（46）：30336-30343.

［18］宋海霞，劉文鋒，宋海輝，等.8周不同強度運動對大鼠股四頭肌HSP70和VEGF的影響［J］.中國應用生理學雜志，2012，28（5）：459-461.

［19］步 斌.不同負荷運動對大鼠心肌促血管內皮生長因子表達的影響［J］.中國運動醫(yī)學雜志，2005，24（2）：165-169.

［20］Iemitsu M，Maeda S，Jesmin S，etal.Exercise training improves aging induced downregulation of VEGF angiogenic signaling cascade in hearts［J］.Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2006，291（3）：H1290-1298.

［21］Leosco D，Rengo G，Iaccarino G，et al.Prior exercise improves age-dependentvascular endothelialgrowth factor downregulation and angiogenesis responses to hind-limb ischemia in old rats［J］.JGerontol A Biol Sci Med Sci，2007，62（5）：471-480.