2類多巴胺受體對(duì)心肌缺血后處理保護(hù)作用的影響及機(jī)制*

李鴻珠，高 君，郝曉敏，張麗敏，陳俊亭

缺血后處理（ischemic postconditioning，PC）是指心肌缺血后，在再灌注早期，對(duì)心臟進(jìn)行重復(fù)幾次短暫的再灌注／缺血循環(huán)的處理方法［1］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)此方法能減輕再灌注后心肌的損傷［2］。

多巴胺受體（dopamine receptor，DR）屬于七個(gè)跨膜區(qū)域組成的G蛋白偶聯(lián)受體家族［3］，根據(jù)多巴胺受體的生化和藥理學(xué)特性，將其分為D1樣和D2樣受體，其中D1樣受體又可分為D1和D5受體亞型，主要位于突觸后，受體與腺苷酸環(huán)化酶正性耦聯(lián)，與G蛋白中刺激亞單位（Gs）結(jié)合，激活腺苷酸環(huán)化酶（AC），使cAMP增高，刺激磷脂酶C，從而激活鈣通道，使細(xì)胞內(nèi)鈣增高［3］。D2樣受體可分為 D2、D3、D4受體亞型，分別位于突觸前和突觸后，與腺苷酸環(huán)化酶負(fù)性耦聯(lián)，與 Gi／Gq作用，抑制AC，使 cAMP降低，抑制鈣通道，調(diào)節(jié)鉀通道［3］。當(dāng)今國內(nèi)外對(duì)于DR的研究多集中在精神神經(jīng)系統(tǒng)，心血管系統(tǒng)對(duì)于DR的研究較少，主要涉及其對(duì)高血壓、心臟驟停等影響［4］。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，在大鼠心肌缺血／再灌注損傷過程中，DR2表達(dá)增加［5］；DR2激活通過抑制線粒體、死亡受體途徑及MAPK通路減輕乳鼠心肌細(xì)胞缺血／再灌注損傷及通過促進(jìn)PKCε轉(zhuǎn)位參與大鼠缺血后處理的心肌保護(hù)作用［6-9］。但是，DR2激活在培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞的缺血后處理中的作用及機(jī)制尚未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)利用原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞建立缺血后處理模型，探討DR2激活在心肌缺血后處理中的作用及相關(guān)機(jī)制，這將為缺血性心臟病的防治提供新思路和新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar乳鼠（2～3 d，雄性，8～15 g），由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑

Bromocriptine（Bro）和 Haloperidol（Hal，Sigma），Western及IP細(xì)胞裂解液（Beyotime），DMEM培養(yǎng)液（Hyclone），DR2抗體（Satan），p38、p-p38、JNK、p-JNK抗體（Cell Signaling Technology），LDH、SOD、MDA測(cè)定試劑盒（南京建成），Anexin-V凋亡檢測(cè)試劑盒（北京寶賽），其它試劑均為分析純。

1.3 主要器材

高速低溫離心機(jī)（Beckman），US-640型紫外分光光度計(jì)（Beckman），倒置相差顯微鏡（Olympus），培養(yǎng)箱 MCO-17AICO2（SANYO），Western blot電泳槽（美國BIO-RAD），S-1300-U凈化工作臺(tái)等。

1.4 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)

用70%的酒精浸泡消毒W(wǎng)istar乳鼠，開胸取心，D-Hank’s液清洗2次，剪碎放入10 ml離心管中；加入心肌5倍體積的0.25%胰酶，37℃水浴消化12min，共消化4～5次；除第一次外，每次收集的細(xì)胞懸液，放入等體積的高糖DMEM培養(yǎng)液終止消化后，1500 r／min離心 15 min，棄上清，用含 10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液將沉淀吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾去除未消化組織塊。用差速貼壁分離法去除成纖維細(xì)胞，將純化心肌細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以 5×106cells／cm2接種于培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2條件下孵育培養(yǎng)。隔天換液，取第4天的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 心肌細(xì)胞缺血后處理模型的建立及分組

正常對(duì)照組（Control）：細(xì)胞正常培養(yǎng)，未施加任何因素，培養(yǎng)時(shí)間同實(shí)驗(yàn)組；模擬缺血／再灌注組（ischemia／reperfusion，I／R）：心肌細(xì)胞模擬缺血 3 h，再灌6 h處理。（模擬缺血缺氧液為無血清、無糖培養(yǎng)基，pH＝6.8，置于缺氧罐中，通入 95%N2，5%CO2）；模擬缺血后處理組（ischemic postconditioning，PC）：方法同缺血／再灌注組，在缺血結(jié)束再灌前連續(xù)進(jìn)行3次5 min間隔的再灌注／再缺血處理，繼之恢復(fù)持續(xù)灌注；PC＋DR2激動(dòng)劑（Bromocriptine，Bro）組（PC＋Bro）：同缺血后處理組，在再灌注前10 min加入 Bro，后同 PC組；PC ＋ DR2抑制劑（Haloperidol，Hal）組（PC＋Hal）：同缺血后處理組，在再灌注前10min加入Hal，后同PC組；PC＋DR2抑制劑＋DR2激動(dòng)劑組（PC＋Hal＋Bro）：方法同缺血后處理，在再灌注前20 min加入Hal，在再灌注前10min注入 Bro。

1.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)情況

取各組心肌細(xì)胞，PBS洗滌后加入全細(xì)胞裂解液，冰浴 40 min，4℃，15 000 r／min離心 15 min，取上清進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。取50μg蛋白樣品于10%SDSPAGE凝膠電泳；隨后轉(zhuǎn)印于 PVDF濾膜上，用5%脫脂奶粉，37℃封閉1 h；用封閉液稀釋一抗，4℃震蕩過夜；TBST稀釋二抗（1／2 000的羊抗兔IgG二抗，堿性磷酸酶標(biāo)記），室溫振蕩孵育2 h；最后顯色，凝膠成像系統(tǒng)下拍照，計(jì)算條帶光密度值，蛋白表達(dá)水平以其與GAPDH光密度比值來表示。

1.7 LDH、SOD活力及 MDA含量的測(cè)定

取各組細(xì)胞的培養(yǎng)液，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度：標(biāo)準(zhǔn)品為牛血清白蛋白；按試劑盒說明書操作；紫外分光光度計(jì)上讀出吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞的LDH和SOD活力以及MDA水平。

1.8 透射電鏡觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

用0.25%胰酶消化細(xì)胞 4 min，PBS洗滌1次，2 000 r／min離心 10 min后棄上清收集細(xì)胞；4℃，2.5%戊二醛固定；1%鋨酸固定，常規(guī)乙醇、丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，鉛鈾雙重染色，透射電鏡下觀察心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)并攝片。

1.9 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

取各組心肌細(xì)胞，0.25%胰酶消化，PBS洗滌2次后調(diào)整細(xì)胞密度為1×106cells／L，制成單細(xì)胞懸液；加入由100μl Binding Buffer和 FITC標(biāo)記的Annexin-V（20μg／ml）10μl，室溫避光 30min；加入 PI（50 μg／ml）5μl，避光 5 min；加入 400μl Binding Buffer，立即用流式細(xì)胞儀（FACScan）進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.1 0 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，全部數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 10.1統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行，采用方差分析及配對(duì)t檢驗(yàn)判斷其差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 不同組DR2蛋白表達(dá)變化

（1）DR2蛋白表達(dá)變化用 DR2／GAPDH表示，與Control組（0.49±0.06）相比，I／R組 DR2蛋白表達(dá)增加（0.74±0.11，P＜0.01）；（2）與 I／R組比較，PC組 DR2蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加（1.19±0.10，P＜0.01）；（3）Bro上調(diào) PC引起的 DR2蛋白表達(dá)增加（1.86±0.07），Hal則可取消 Bro的這種作用（0.77±0.08，圖 1）。

Fig.1 Protein levels of DR2（n＝4）I／R：Ischemia／reperfusion；PC：Ischemic postconditioning；PC＋Bro：Ischemic postconditioning＋Bromocriptine；PC＋Hal：Ischemic postconditioning＋Haloperidol；PC＋Hal＋Bro：Ischemic postconditioning＋Haloperidol＋Bromocriptine**P＜0.01 vs controlgroup；＃＃P＜0.01 vs I／R group；△△P＜0.01 vs PC group；▲▲P＜0.01 vs PC＋Bro group

2.2 不同組LDH和SOD活性以及MDA含量的變化

（1）與 Control比較，I／R顯著增加 LDH活性和MDA含量，降低 SOD活性（P＜0.01）；（2）與 I／R組比較，PC顯著降低LDH活性、MDA含量，升高SOD活性（P＜0.01）；（3）與 PC組比較，Bro進(jìn)一步降低LDH活性、MDA含量，升高 SOD活性（P＜0.01），Hal則可取消Bro的這種作用（表1）。

2.3 各組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

Control組：核膜清楚，染色質(zhì)均勻分布，線粒體結(jié)構(gòu)完好；I／R組：線粒體腫脹和空泡化，肌絲溶解，脊斷裂，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；PC組：核膜結(jié)構(gòu)較完好，染色質(zhì)部分凝聚，少量線粒體空泡化；PC＋Bro組：細(xì)胞損傷程度較PC組減輕；PC＋Hal和PC＋Hal＋Bro組：細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化同PC組相似（圖 2）。

Tab.1 Changes of LDH and SOD activity and MDA content in cellmedium（ˉx±s，n＝8）

Fig.2 The ultrastructure of cardiomyocytes using transmission electronmicroscopy（×8 000）A：Control；B：Ischemia／reperfusion（I／R）；C：Ischemic postconditioning（PC）； D： Ischemic postconditioning＋Bromocriptine（PC＋Bro）；E：Ischemic postconditioning＋Haloperidol（PC＋Hal）；F：Ischemic postconditioning＋Haloperidol＋Bromocriptine

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

（1）正常組心肌細(xì)胞凋亡率僅為 6.53%±0.57%；（2）I／R組心肌細(xì)胞凋亡率為 65.63% ±2.89%，明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；（3）與 I／R組比較，PC組心肌細(xì)胞凋亡率明顯減少（54.50%±1.72%，P＜0.01）；（4）與 PC組比較，Bro進(jìn)一步降低細(xì)胞凋亡率（30.71%±2.41%，P＜0.01）；Hal則取消 Bro的這種作用（41.81%±2.63%，圖 3）。

Fig.3 Detection the apoptosis rate of cardiomyocytes by FCM（n＝6）I／R：Ischemia／reperfusion；PC：Ischemic postconditioning；PC＋Bro：Ischemic postconditioning＋Bromocriptine；PC＋Hal：Ischemic postconditioning＋ Haloperidol；PC＋Hal＋Bro：Ischemic postconditioning＋Haloperidol＋Bromocriptine**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs I／R group；△△P＜0.01 vs PC group；▲▲P＜0.01 vs PC＋Bro group

2.5 Western blot檢測(cè)各組p-p38和p-JNK活性的變化

（1）與正常組相比，I／R增加 p-p38和 p-JNK的活性（P＜0.01）；（2）與 I／R組比較，PC降低 p-p38和p-JNK的活性（P＜0.01）；（3）與 PC組比較，Bro進(jìn)一步降低p-p38和p-JNK的活性，Hal則可取消Bro的這種作用（圖 4，表 2）。

Fig.4 The changes of p-p38 and p-JNK activities in defferent groups（n＝4）C：Control；I／R：Ischemia／reperfusion；PC：Ischemic postconditioning； PC ＋ Bro： Ischemic postconditioning ＋Bromocriptine； PC＋ Hal： Ischemic postconditioning ＋Haloperidol；PC＋Hal＋Bro：Ischemic postconditioning＋Haloperidol＋Bromocriptine

Tab.2 Results analysis of p-p38 and p-JNK expressions in cardiomyocytes from different groups（ˉx±s，n＝4）

3 討論

缺血性心臟病嚴(yán)重危害人類健康，盡早恢復(fù)血流是減輕缺血心肌損傷的關(guān)鍵，但是再灌注療法受缺血組織血管再通時(shí)間的限制，并存在再灌注損傷等問題。因此，減輕再灌注損傷成為醫(yī)學(xué)界亟待解決的重大問題［10，11］。2003年，Zhao等在犬心肌缺血后再灌注前進(jìn)行3次30 s的再灌注，保護(hù)冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能，限制心肌梗死范圍，稱為缺血后處理［1］。目前已在多種屬動(dòng)物模型上證實(shí)缺血后處理是在缺血后實(shí)施的強(qiáng)有力的內(nèi)源性心臟保護(hù)現(xiàn)象，但機(jī)制不詳。本實(shí)驗(yàn)利用乳鼠心肌細(xì)胞建立缺血后處理模型，觀察DR2激活在心肌缺血后處理中的作用并探討其機(jī)制。

透射電鏡結(jié)果顯示：在I／R后乳鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)線粒體腫脹和空泡化，肌絲溶解，脊斷裂，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；同時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH漏出增多。這些結(jié)果均表明I／R導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生明顯的損傷。LDH外漏程度可反映細(xì)胞損傷程度；SOD活性可反映機(jī)體清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化的能力；MDA含量可反映氧自由基產(chǎn)生和組織的受損程度。本研究結(jié)果顯示：與Control組相比，I／R組培養(yǎng)液中MDA含量顯著增加、SOD活性明顯降低，這表明I／R性心肌損傷與自由基生成增多有關(guān)。與I／R組比較，PC組LDH活性和MDA含量顯著降低，SOD活性明顯升高；并且透射電鏡結(jié)果顯示：核膜結(jié)構(gòu)較完好，染色質(zhì)部分凝聚，少量線粒體空泡化；這說明PC可減輕心肌細(xì)胞I／R損傷，其機(jī)制與清除自由基相關(guān)。

大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證明，PC可誘導(dǎo)觸發(fā)因子釋放，經(jīng)多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的介導(dǎo)，作用于多種效應(yīng)器，影響氧自由基產(chǎn)生、鈣超載等I／R損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)而發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用［11］。主要的信號(hào)通路包括磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）、絲裂素活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPKs）、蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）、蛋白激酶 G（protein kinase G，PKG）、蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、酪氨酸激酶和JAK／STAT等［11］。

MAPKs通路是生物體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、分化、增殖、凋亡等多種生理過程［7］，其主要包括 ERK、p38和 JNK三條途徑，其中，ERK被激活后主要與細(xì)胞增殖與分化相關(guān)，p38與 JNK被激活后主要與細(xì)胞凋亡相關(guān)［12］。本研究結(jié)果顯示：I／R組心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高，p-p38和p-JNK活性均明顯上調(diào)，而PC降低細(xì)胞凋亡率，下調(diào)p-p38、p-JNK的活性，這表明 PC通過抑制p-p38和p-JNK的活性減輕心肌細(xì)胞I／R損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示：Bro（DR2的激動(dòng)劑）可進(jìn)一步增加PC減輕心肌I／R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和凋亡以及增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力；另外，Bro也可增強(qiáng)PC抑制p-p38和p-JNK活性的能力。

本實(shí)驗(yàn)過程中，PC處理的各組比Control和I／R組所用時(shí)間延長(zhǎng)15 min，但是眾所周知，PC對(duì) I／R損傷具有保護(hù)作用，因此，與I／R組相比，PC處理的各組的心肌損傷是減輕的。

綜上所述，DR2激活參與PC減輕心肌I／R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和凋亡，其機(jī)制與下調(diào)p-p38和p-JNK的活性有關(guān)。結(jié)合我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，激活心肌DR2有望為缺血性心臟病的防治提供新靶點(diǎn)。

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