陳連祥 朱小偉 邢駿 姚明玲 葉靜 陸一鳴

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.12.029

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81270433，81171846，81372099）

作者單位：200025 上海，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院中法生命科學(xué)和基因組研究中心急診科

通信作者： 陸一鳴，E-mail：luyiming@rjh.com.cn;

葉靜，E-mail：yj11254@gmail.com

端粒特異性保護(hù)蛋白復(fù)合體（shelterin）是與端粒結(jié)合的六蛋白復(fù)合體，包括：TRF1， TRF2， TIN2， Rap1， TPP1和 POT1。6種成分以不同的方式參與維持端粒的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定：（1）TRF1和TRF2負(fù)性調(diào)節(jié)端粒長度。（2）TRF2介導(dǎo)t-環(huán)結(jié)構(gòu)形成^[1-2]以及穩(wěn)定 t-環(huán)結(jié)構(gòu)^[3]，與拓?fù)洚悩?gòu)酶II相互作用維持端粒的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)^[4]。（3）POT1、Rap1等維持3 懸臂穩(wěn)定。（4）Shelterin蓋帽作用抑制DNA損傷系統(tǒng)激活^[5]。（5）shelterin還能募集大量非端粒特異性蛋白成員，包括ERCC1/XPF，Apollo等形成端粒蛋白網(wǎng)絡(luò)，共同協(xié)同參與端粒保護(hù)和端粒復(fù)制延伸^[6]。正是由于shelterin的作用，使得端粒得以躲過DNA損傷反應(yīng) （DNA Damgae Response， DDR）體系的攻擊，并在維護(hù)染色體穩(wěn)定、避免染色體末端受核酸酶降解和基因重排中起重要作用。大量研究表明shelterin除保護(hù)端粒作用外，其可參與細(xì)胞多種反應(yīng)過程，本文將重點(diǎn)講述shelterin在氧化應(yīng)激進(jìn)程中作用。

1端粒是氧化應(yīng)激重要靶點(diǎn)

氧化應(yīng)激在細(xì)胞內(nèi)普遍存在，主要有活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）及活性氮簇（reactive nitrogen species，RNS），參與體內(nèi)炎癥、代謝等重要生命過程，維護(hù)正常生命活動。正常機(jī)體處于氧化與抗氧化的均衡體系中，當(dāng)系統(tǒng)失衡時ROS可直接或間接氧化損傷DNA，誘發(fā)基因突變，導(dǎo)致多種疾病發(fā)生，如重癥急性胰腺炎^[7]，膿毒癥^[8]，肺損傷^[9]等。有關(guān)ROS是如何激活炎癥介質(zhì)，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)和臟器功能衰竭的機(jī)制目前仍是未知。

端粒位于染色體末端的定位特點(diǎn)以及富含G-基因重復(fù)序列和3懸突（G tail）的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使得端粒成為潛在“脆弱位點(diǎn)”，比其他部位更易受到氧化應(yīng)激損傷。端粒的結(jié)構(gòu)性損傷影響shelterin與端粒的結(jié)合穩(wěn)定性^[10]和表達(dá)，為其參與氧化應(yīng)激進(jìn)程提供可能。以上提示，在ROS介導(dǎo)的炎性反應(yīng)和臟器功能衰竭中，端粒和shelterin很可能是中心靶點(diǎn)。

2端粒保護(hù)蛋白復(fù)合體在抑制氧化損傷中的作用

2.1TRFs通過招募PARPs參與氧化應(yīng)激

聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerases，PARPs）在體內(nèi)發(fā)揮基因組監(jiān)視和保護(hù)作用， TRFs與端粒的結(jié)合受到PARPs的調(diào)節(jié)。其中PARP1，PARP2影響TRF2 ^[11]， PARP5與TRF1相互作用^[12]。PARP2與TRF2有高度的親和力，通過共價結(jié)合和非共價結(jié)合兩種方式作用負(fù)性調(diào)節(jié)TRF2與端粒的結(jié)合。

ROS可以激活PARPs，在氧化損傷區(qū)域可以觀察到PARPs的聚集。氧化應(yīng)激產(chǎn)生8oxoG，其有效修復(fù)需要PARP1的參與，主要通過堿基切除修復(fù)（base excision repair， BER）途徑^[13]。PARPs能夠募集BER相關(guān)蛋白，如XRCC1，在敲除PARP2的MEFs中可明顯觀察到染色體和染色質(zhì)的斷裂增加以及端粒重復(fù)序列丟失增加。發(fā)生氧化應(yīng)激時端粒區(qū)域內(nèi)PARPs的聚集，負(fù)性TRFs與端粒結(jié)合，引起TRFs丟失，從而引起一系列反應(yīng)。此途徑如圖1。

內(nèi)源性和外源性的ROS可以造成端粒DNA的各種損傷，如單鏈損傷，8-oxoG等等。端粒DNA的損傷能夠抑制TRFs與端粒的結(jié)合。另外在端粒損傷時，相關(guān)修復(fù)蛋白在損傷處聚集，如PARPs。 PARPs能夠負(fù)性調(diào)節(jié)TRFs與DNA的結(jié)合能力，最終導(dǎo)致TRFs在端粒的丟失。端粒失去保護(hù)而引起端粒的縮短和失功能，誘發(fā)DNA損傷反應(yīng)，可以造成細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期停滯以及多種疾病如腫瘤發(fā)生。

圖1TRFs 在端粒氧化損傷中作用

2.2RAP1調(diào)控NF-κB參與氧化應(yīng)激

由于本身缺乏DNA結(jié)合能力，RAP1必須通過結(jié)合于TRF2而間接定位于端粒^[14]，從而發(fā)揮保護(hù)端粒作用，避免發(fā)生非同源末端的融合^[15]。在氧化應(yīng)激中，由于TRF2的結(jié)合減少，可以導(dǎo)致RAP1的丟失，增加端粒的重組和脆性。

最近研究顯示，RAP1可以通過與端粒外TTAGGG序列結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要作用，此部分RAP1稱之為胞漿RAP1^[5]。RAP1通過NF-κB途徑參與調(diào)節(jié)組織的氧化損傷。NF-κB涉及到體內(nèi)一系列的基因表達(dá)的調(diào)控， DNA結(jié)合的NF-κB是一個雜化二聚體，分別為50 000（p50）和65 000（p65）的兩個多肽亞基，但是僅p65具有激活轉(zhuǎn)錄活性^[16]。NF-κB的活性主要受到抑制亞基IκB的控制^[17]。IκB阻斷NF-κB與DNA的結(jié)合，進(jìn)而限制NF-κB對于損傷的反應(yīng)速率，這是NF-κB反應(yīng)的限速步驟。當(dāng)IκB磷酸化后脫離NF-κB，從而解除其抑制作用。而IκB的磷酸化受到IκB激酶（IκB kinases，IKKs）的調(diào)節(jié)，包括IKK1和 IKK2^[18]。證據(jù)表明RAP1作為IKKs的適配器，RAP1與IKKs的結(jié)合是激活NF-κB以來基因表達(dá)的關(guān)鍵^[19]。 在哺乳動物，RAP1能夠增強(qiáng)募集IKKs復(fù)合體到p65，進(jìn)而使p65在ser536磷酸化，從而激活NF-κB途徑。而激活的NF-κB又可以增加RAP1的表達(dá)。此途徑如圖2。

氧化應(yīng)激引起端粒損傷如8oxoG。一方面，由于TRF2的丟失造成端粒RAP1的丟失，增加端粒的脆性和重組機(jī)率。另一方面，RAP1參與到NF-κB途徑。氧化損傷時，RAP1可以募集IKKs到IκB，從而使IκB磷酸化進(jìn)而解除對于NF-κB抑制，同時使p65磷酸化而具背激活轉(zhuǎn)錄活性?；罨腘F-κB又可以增加RAP1表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)NF-κB途徑的活化。

圖2RAP1在氧化應(yīng)激中作用

2.3TIN2影響線粒體ROS產(chǎn)生

線粒體生成ATP同時產(chǎn)生ROS，被認(rèn)為是細(xì)胞產(chǎn)生ROS的主要途徑，造成線粒體DNA更易于受到氧化應(yīng)激的損傷，誘發(fā)許多疾病的發(fā)生，如心血管疾病^[20];以及衰老^[21]。TIN2與TRF1， TRF2， 和 TPP1相互作用，使得單鏈和雙鏈結(jié)合的shelterin成分形成一個整體^[22]。研究顯示TIN2可以定位于端粒外結(jié)構(gòu)，特別是線粒體^[23]。TIN2通過其氮端信號序列以及TPP1在線粒體定位，影響線粒體的形態(tài)和活性。TIN2敲除時，可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生減少;當(dāng)恢復(fù)TIN2水平時，ROS的產(chǎn)生得以恢復(fù)。

3端粒及shelterin-藥物作用新的靶點(diǎn)

臨床研究顯示，氧化損傷會通過端粒加重一些慢性疾病的發(fā)生。端粒長度比平均值短的人，其患缺血性心肌病的幾率是正常人的3倍^[24]，短的白細(xì)胞端粒長度與胰島素依賴型糖尿病（非2型）^[25]以及高血壓^[26]發(fā)生息息相關(guān)。在急危重癥中微循環(huán)的障礙導(dǎo)致氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，進(jìn)而引發(fā)多起功能衰竭^[27]。通過抑制氧化應(yīng)激可以抑制致病因子引起的損傷，如利用依達(dá)拉奉抑制百草枯引起的氧化應(yīng)激，從而減輕其造成的肺損傷^[28]。因此端粒以及shelterin成分表達(dá)異常和端粒結(jié)合異常，在治療氧化應(yīng)激相關(guān)疾病時可以作為重要的作用靶點(diǎn)。

對于端粒作為藥物靶點(diǎn)已做了一些前期研究如端粒酶和G四聯(lián)體抑制劑，通過抑制端粒酶來損耗端粒導(dǎo)致細(xì)胞死亡，以治療端粒酶陽性腫瘤^[29]。此外端粒位置效應(yīng)（telomere position effect，TPE）已可以作為藥物作用重要靶點(diǎn)，如Acacetin和 Chrysin能夠緩解人體細(xì)胞端粒位置效應(yīng)^[30]?？梢姸肆＜皊helterin作為藥物作用靶點(diǎn)是可以實(shí)現(xiàn)的。

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（收稿日期：2014-06-07）

（本文編輯：何小軍）

p1415-1417