李莉 古正濤 劉志鋒 蘇磊

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.12.006

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81071529，81101467）;廣東省自然科學(xué)基金（10151001002000001）;廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012B031800416）;軍隊(duì)十二五醫(yī)學(xué)科研基金重點(diǎn)項(xiàng)目（BWS12J018）

作者單位：510010廣州，南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（李莉、古正濤）; 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科全軍熱區(qū)創(chuàng)傷救治與組織修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（劉志鋒、蘇磊）

通信作者：蘇 磊， Email： sulei_icu@163.com

【摘要】目的觀察細(xì)胞色素C、caspase-9和caspase-3在熱應(yīng)激后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)及相互關(guān)系，闡明熱應(yīng)激后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，探討重癥中暑所致血管內(nèi)皮損害的發(fā)病機(jī)理。方法 建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞熱應(yīng)激模型，對照組將細(xì)胞置于標(biāo)準(zhǔn)37 ℃、5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱，熱應(yīng)激組將細(xì)胞置于39 ℃、41 ℃、43 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行熱應(yīng)激2 h，熱應(yīng)激后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h。電子顯微鏡觀察人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（3 7℃、43 ℃）線粒體改變，應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙染色方法檢測不同溫度熱應(yīng)激后細(xì)胞凋亡率、Western blot 檢測細(xì)胞色素C、caspase-9、caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果 ?電鏡觀察對照組（37 ℃）HUVEC細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)基本正常。熱應(yīng)激后（43 ℃）HUVEC細(xì)胞線粒體腫脹并出現(xiàn)結(jié)構(gòu)改變;與對照組比較，39℃熱應(yīng)激對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡無明顯影響（P>0.05），隨著熱應(yīng)激溫度的增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡明顯增多（41 ℃ 17.8%，4 3℃ 25.6%）并且細(xì)胞色素C、caspase-9、caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.05）。結(jié)論線粒體通路的激活參與了熱應(yīng)激后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控;血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可能與重癥中暑的發(fā)病存在相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;凋亡;線粒體;熱應(yīng)激;重癥中暑;細(xì)胞色素C;caspase-9、caspase-3

Mitochondrial apoptosis pathway involved in apoptosis of human umbilical vein endothelial cell after heat stress Li Li*， Gu Zhengtao，Liu Zhifeng，Su Lei. Department of Intensive Care Unit， The Third Affiliated Hospital of Southern Medical University， Guangzhou 510010， China

Corresponding authors： Su Lei，Email：sulei_icu@163.com

【Abstract】ObjectiveTo observe the expressions of cytochrome C， Caspase-9， Caspase-3 and their relationships， and investigate apoptosis signal transduction mechanism after heat stress-induction in human umbilical vein endothelial cell（HUVEC）， and explore pathogenesis of vascular endothelial damage in the wake of severe heat stroke. Methods Human umbilical vein endothelial cell heat stress model was set up. Control group were incubated at 37°C， while heat stress group of cells were incubated at 39°C， 41°C， and 43°C for 2h， then all the cells were further incubated at 37°C for 24 h. Mitochondria of human umbilical vein endothelial cell were examined with electron microscopy.Apoptosis was analyzed by flow cytometry using Annexin V-FITC/PI staining， and protein levels of cytochrome C， caspase-9， caspase-3 were analyzed by western blot. Results ?In the control group （37°C）， the structure of mitochondrial was intact in HUVEC under transmission electron microscope. In contrast， mitochondrial ?swelling was found in the group of 43°C heat stress. Compared with control group， as increasing in heat stress temperature， the rates of induced apoptosis were 17.8% at ?41℃ and 25.6% at 43℃， and the levels of cytochrome C， Caspase-9， and caspase-3 were significantly increased（P<0.05）.There was no obvious change at 39℃ heat stress （P>0.05）.ConclusionsMitochondrial apoptosis pathway is involved in apoptosis of human umbilical vein endothelial cells in the wake of heat stress. The vascular endothelial cells apoptosis may be associated with the occurrence of severe heat stroke.

【Key words】Human umbilical vein endothelial cell;Apoptosis; Mitochondrial;Heat stress;Severe heatstroke;Cytochrome C;Caspase-9;Caspase-3

重癥中暑（severe heatstroke）是一種高發(fā)病率和高病死率的急性重癥疾病，主要表現(xiàn)為：中心體溫>40 ℃，譫妄、抽搐或昏迷，常合并多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome， MODS）^[1-2]。隨著對于重癥中暑認(rèn)識的不斷深入，血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cells，VEC）在重癥中暑發(fā)病中的作用越來越得到重視，其結(jié)構(gòu)及功能損傷是引發(fā)MODS等嚴(yán)重并發(fā)癥的重要因素^[3-4]。目前的研究以描述重癥中暑與VEC損傷表象之間的相關(guān)性為主，機(jī)制方面的研究報(bào)道較少。盡管，重癥中暑發(fā)病機(jī)制并不完全明確，但越來越多的研究已經(jīng)證實(shí)高熱可誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡^[5-6]。本研究旨在通過觀察熱應(yīng)激后細(xì)胞色素C、caspase-9和caspase-3在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)及相互關(guān)系，闡明熱應(yīng)激后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，探討重癥中暑所致血管內(nèi)皮損害的發(fā)病機(jī)理。

1材料與方法

1.1儀器

A200144 CO₂孵箱 （中國 上海艾測電子科技有限公司）;倒置相差顯微鏡（德國Leica）、熒光顯微鏡（德國Leica）、透射電子顯微鏡（FEI Tecnai G212， Holland）、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（ DMR） 圖像分析（德國Leica）;流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品;酶標(biāo)光度計(jì)為美國BIO-RAD產(chǎn)品;貝克曼GS-15R高速冷凍離心機(jī)（ 美國）。

1.2人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株培養(yǎng)

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVEC ）為廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科創(chuàng)建并保存。HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)于含600 mg/mL葡萄糖的DMEM加10%胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的培養(yǎng)液中。將細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO₂及飽和濕度條件的孵箱中培養(yǎng)。約2～3 d進(jìn)行1次傳代，傳代按1∶2～1∶3的比例進(jìn)行。細(xì)胞長至對數(shù)生長期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3熱應(yīng)激后細(xì)胞存活率測定

取對數(shù)生長期HUVEC細(xì)胞，按5×104/孔密度鋪入96孔板，待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后進(jìn)行熱應(yīng)激處理。對照組將細(xì)胞置于標(biāo)準(zhǔn)37 ℃、5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱2 h，熱應(yīng)激組分別置于39 ℃、41 ℃、43 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中2 h，各組分別設(shè)置5個復(fù)孔。熱應(yīng)激后繼續(xù)在37 ℃、5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h后加入CCK8（碧云天）10 μL/孔，操作參考說明書。用酶聯(lián)免疫檢測儀于450 mm 處讀取吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)分別獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4電子顯微鏡HUVEC細(xì)胞切片制備

熱應(yīng)激組為將細(xì)胞置于43℃ 孵育2h，對照組37℃孵育 2h，熱應(yīng)激后分別繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24h。收集細(xì)胞，并用戊二醛固定，常規(guī)方法制作超薄切片（0.1μm），醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，透射電子顯微鏡觀察。

1.5Annexin V /PI流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

熱應(yīng)激組為將細(xì)胞置于39 ℃、41 ℃、43 ℃ 孵育2 h，對照組37 ℃孵育 2 h，熱應(yīng)激后分別繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h。使用Annexin V/PI試劑盒（invitrogen），按說明書進(jìn)行操作，調(diào)整待檢測細(xì)胞濃度為1×106/mL，冰PBS潤洗兩次2次，將細(xì)胞重懸于100 μL含2 μL Annexin-V-FITC（20 μg/mL） 緩沖液中輕輕混勻，避光室溫放置15 min，轉(zhuǎn)至流式檢測管，加入400 μLPBS，每個樣品臨上機(jī)前加入1 μL PI（50μg/mL），2 min后迅速檢測。流式細(xì)胞儀檢測激發(fā)波長Ex=488 nm;發(fā)射波長Em=530 nm。

1.6細(xì)胞色素C、caspase-9、caspase-3表達(dá)

收集對照組與熱應(yīng)激組的細(xì)胞，按細(xì)胞組分分離試劑盒說明書提取線粒體與細(xì)胞質(zhì)。BCA法定量后，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，洗膜后加入一抗鼠來源細(xì)胞色素C抗體（1∶200，Cell Signaling Technology）、caspase-9兔來源激活型抗體（1∶1000，Cell Signaling Technology）、caspase-3兔來源激活型抗體（1∶1000，碧云天），4 ℃過夜，TBST洗三遍后，加入二抗結(jié)合有辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠/兔抗體（1∶5000， 碧云天），室溫孵育2 h后使用化學(xué)發(fā)光劑ECL（Amersham公司）進(jìn)行反應(yīng)、曝光。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。計(jì)量資料，在方差齊性的基礎(chǔ)上應(yīng)用單因素方差分析（one-way ANOVA）， 組間差異用LSD法比較， P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1熱應(yīng)激后HUVEC細(xì)胞活力下降

39 ℃（89.67±1.86）熱應(yīng)激對HUVEC細(xì)胞活力無影響（P=0.023），但隨著熱應(yīng)激溫度的不斷提高（41 ℃：70.17±4.30，43 ℃：48.17±5.49），HUVEC細(xì)胞活力呈現(xiàn)出進(jìn)行性下降趨勢，與對照組（37 ℃：94.83±0.75）比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.05），見圖1。

與對照組比較，aP<0.05

圖1不同溫度熱應(yīng)激后HUVEC細(xì)胞存活率檢測

Fig1Cell viability of HUVEC at different temperature during ?heat stress

2.2電子顯微鏡觀察熱應(yīng)激后HUVEC細(xì)胞線粒體變化

對照組（37 ℃）HUVEC細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)基本正常。熱應(yīng)激后（43 ℃）HUVEC細(xì)胞線粒體腫脹，其雙層膜和嵴結(jié)構(gòu)消失，線粒體基質(zhì)均質(zhì)化改變（線粒體嵴溶解物、基質(zhì)及含染色質(zhì)物質(zhì)相混合在一起形成致密均質(zhì)團(tuán)塊物），見圖2。

與對照組比較，aP<0.05

圖2不同溫度熱應(yīng)激后HUVEC細(xì)胞線粒體改變

Fig2Mitochondrial change in HUVEC at different temperature during ?heat stress

2.3熱應(yīng)激后HUVEC細(xì)胞凋亡增加

與對照組37 ℃（3.4±0.36）比較，39 ℃（4.3±0.40）熱應(yīng)激組并未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡有明顯增加（P=0.339），但在41 ℃、43 ℃熱應(yīng)激后細(xì)胞凋亡開始明顯增加，細(xì)胞凋亡顯示出熱應(yīng)激后溫度依賴性增加（41 ℃：17.8±1.53，43℃：25.45±1.97），與對照組（37 ℃）比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.05），見圖3。

與對照組比較，aP<0.05

圖3不同溫度熱應(yīng)激后HUVEC細(xì)胞凋亡比較

Fig3Comparison of apoptotic HUVEC at different temperature during heat stress

2.4線粒體通路的激活參與了熱應(yīng)激后HUVEC細(xì)胞凋亡的調(diào)控

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，39 ℃熱應(yīng)激組線粒體中細(xì)胞色素C蛋白水平無顯著下降，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素C、caspase-9、caspase-3表達(dá)無明顯升高，與對照組37 ℃比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.356、P=0.180、P=0.069）;而隨著熱應(yīng)激溫度增加（41～43 ℃）線粒體中細(xì)胞色素C蛋白水平下降明顯，胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞色素C、 caspase-9、caspase-3表達(dá)顯著增高，與對照組37 ℃比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（41 ℃：P=0.001、0.001、0.001，43 ℃：P=0.001、0.001、0.001，圖4），其趨勢與細(xì)胞凋亡趨勢一致，推測線粒體通路的激活參與了熱應(yīng)激后HUVEC細(xì)胞凋亡的調(diào)控。

與對照組比較，aP<0.05

圖4HUVEC細(xì)胞在不同溫度熱應(yīng)激后細(xì)胞色素C、caspase-9、caspase-3蛋白比較

Fig2Comparison of cytochrome C ，caspase-9，caspase-3in HUVEC at different temperature during heat stress

3討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞廣泛分布于全身各個部位，對血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的維持和各組織器官正常功能的發(fā)揮起著重要作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷可由多種刺激引起，其中凋亡是血管內(nèi)皮損傷的重要機(jī)制之一^[3]。重癥中暑時內(nèi)皮細(xì)胞損傷較早，其損傷可以啟動彌散性血管內(nèi)凝血、誘發(fā)微循環(huán)障礙，最終導(dǎo)致MODS^[4，7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，高溫和熱輻射可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并在重癥中暑病理生理過程中起著非常重要的作用^[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著熱應(yīng)激溫度的增加（37～43 ℃），HUVEC細(xì)胞凋亡的發(fā)生不斷增加，尤其是43 ℃熱應(yīng)激可導(dǎo)致HUVEC細(xì)胞發(fā)生大量凋亡，與筆者前期結(jié)果一致^[9-10]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，線粒體通路的激活與熱應(yīng)激誘導(dǎo)的HUVEC凋亡密切相關(guān)。

線粒體是真核細(xì)胞生命活動的中心，它不僅僅是細(xì)胞賴以生存的產(chǎn)能場所，同時也是調(diào)控細(xì)胞凋亡時重要的細(xì)胞器，在細(xì)胞凋亡中處于中心地位^[11-12]。細(xì)胞色素C是線粒體中第一個被鑒定出來的細(xì)胞凋亡分子^[13]，它從線粒體釋放到胞漿，被認(rèn)為是線粒體途徑介導(dǎo)凋亡信號通路中的關(guān)鍵事件^[14-17]。筆者的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著熱應(yīng)激溫度的增加（41～43 ℃），HUVEC細(xì)胞線粒體中細(xì)胞色素C逐漸降低，在43 ℃熱應(yīng)激時表達(dá)最低，而胞質(zhì)中細(xì)胞色素C呈相反表達(dá)，表現(xiàn)為隨著熱應(yīng)激溫度的增加，細(xì)胞色素C表達(dá)不斷增高，從而證實(shí)了HUVEC細(xì)胞經(jīng)過熱應(yīng)激后可以將細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞質(zhì)，推測細(xì)胞色素C的釋放參與誘導(dǎo)了熱應(yīng)激后HUVEC細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

在哺乳動物中，caspase家族已發(fā)現(xiàn)14種同源分子caspase1-14，作為凋亡的中心執(zhí)行者caspase家族在凋亡過程中大致分為啟動caspase和效應(yīng) caspase 兩類，其中caspase-9是細(xì)胞凋亡的啟動者之一，caspase-3 是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)執(zhí)行者，一旦活化，凋亡不可逆轉(zhuǎn)^[18-19]。當(dāng)?shù)蛲鲂盘杺髦辆€粒體時，線粒體釋放細(xì)胞色素C，胞漿中的細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptosis protease activating factor 1，APAF-1） 結(jié)合^[20]，使其形成多聚體，并促使caspase-9 與其結(jié)合形成凋亡體（apoptosome），激活caspase-9。激活的caspase-9 激活凋亡的效應(yīng)執(zhí)行著caspase-3 ，從而誘導(dǎo)凋亡級聯(lián)反應(yīng)^[21]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HUVEC細(xì)胞經(jīng)過熱應(yīng)激后，細(xì)胞色素C從線粒體釋放至胞漿，隨著熱應(yīng)激溫度增加（41～43 ℃）caspase-9、caspase-3表達(dá)也隨之增加，并與胞漿中細(xì)胞色素C表達(dá)相一致，提示線粒體途徑參與了熱應(yīng)激后HUVEC細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

隨著全球氣候變暖，以及世界范圍內(nèi)熱浪強(qiáng)度和頻度的增加，推測重癥中暑的發(fā)病率及病死率將會進(jìn)一步攀升，因此深入研究重癥中暑的發(fā)病機(jī)制具有深刻的現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)通過觀察熱應(yīng)激后細(xì)胞色素C、caspase-9和caspase-3在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)及相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)線粒體通路的激活參與了熱應(yīng)激后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控;血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可能與重癥中暑的發(fā)病存在相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)只研究了線粒體途徑參與的熱應(yīng)激后HUVEC細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并不排除其他非線粒體途徑凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的存在。

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（收稿日期：2014-06-04）

（本文編輯：何小軍）

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