殼聚糖載黃芪多糖納米粒調(diào)節(jié)糖尿病小鼠免疫功能

董德剛，吳亞芬，裘 梁，喻治達(dá)

江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院，南昌 330004

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一種多發(fā)性?xún)?nèi)分泌代謝性疾病，常伴有紅細(xì)胞免疫功能、補(bǔ)體、體液免疫和T 細(xì)胞亞群的異常［1］。目前用于治療的調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的西藥，如白蛋白、免疫球蛋白不僅價(jià)格較貴，患者很難長(zhǎng)期應(yīng)用，且停藥后易反復(fù)，不能根療。天然產(chǎn)物在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，已被廣泛關(guān)注。大量研究表明，從天然藥物黃芪中提取的黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)具有提高機(jī)體免疫力與降血糖作用［2］。另外，將藥物制備成載藥納米粒，可使大分延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，有效提高藥物的利用度，并減少副作用［3，4］。

本實(shí)驗(yàn)以自制的低分散度殼聚糖納米粒為載體，包埋APS，制備低分散度殼聚糖載黃芪多糖納米粒(Low dispersion chitosan load astragalus polysaccharide nanoparticle，LCA)，研究其調(diào)節(jié)DM 小鼠免疫功能及其機(jī)制，為降低DM 并發(fā)癥的發(fā)病率提高可能的方向和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖(CS)，脫乙酰度91.3%，黏度為113 mPa.s，江西省黎川新鑫生物有限公司;殼聚糖酶、黃芪多糖(純度為71.6%)均為實(shí)驗(yàn)室自制;SD 昆明種(KM)小鼠(體重23±3g)，雌雄各半，由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心提供，合格證號(hào)JZDW No:2012-0064;鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，編號(hào)SB0130-100 g)，上海生工;環(huán)磷酰胺(國(guó)藥準(zhǔn)字H32026196)，江蘇恒瑞;ELISA 試劑盒均購(gòu)于武漢博士德;刀豆蛋白(ConA)、MTT 購(gòu)于Sigma 公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1102 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司);BS110S 分析天平(北京賽多利斯天平有限公司);DIF-6050 型真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);恒溫培養(yǎng)箱(國(guó)華電器有限公司);KQ5200E 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);550 型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad);Biofuge stratos 型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Hereaus);RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠(chǎng));ONE TOUCH SureStep 血糖儀及其配套試紙(美國(guó)強(qiáng)生)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 低分散度殼聚糖載黃芪多糖納米粒(LCA)的制備

采用自制內(nèi)切殼聚糖酶降解，粘度法［5］測(cè)定低分散度殼聚糖粘均分子量為1.79 ×105Da，離子交聯(lián)法［6］制備低分散度殼聚糖納米粒，冷凍干燥，待用。

將APS 與上述低分散度殼聚糖納米粒按一定比例混合(以殼聚糖氨基含量為準(zhǔn)，APS 過(guò)量)，加一定量的蒸餾水，室溫下24 kHz 超聲10 min，充分溶解后轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)，置于1L 蒸餾水中透析24 h，在12 h 更換新鮮蒸餾水，24 h 后將透析袋中溶液8000 rpm 離心10 min，除去未包埋APS，上清液冷凍干燥得LCA，采用紫外分光光度法測(cè)定黃芪多糖含量［7］，差量法計(jì)算低分散度殼聚糖納米粒載藥量:

1.3.2 動(dòng)物分組與給藥

KM 小鼠80 只，隨機(jī)分組，每組16 只，設(shè)模型組，APS 組，LCA 低、中、高劑量組。各組適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，禁食12 h 后腹腔一次性注射60 mg/kg STZ 溶液(pH 4.5，0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液，0.22 μm 濾膜除菌)，72 h 后眶后靜脈叢采血，測(cè)血糖。以血糖≥16.7 mmol/L 者為造模成功，血糖值＜16.7 mmol/L者追加25 mg/kg STZ。DM 小鼠腹腔注射給藥，低、中、高劑量組灌胃150、350、450 mg/(kg·d)LCA，模型組灌胃等量生理鹽水，APS 組灌胃280 mg/(kg·d)黃芪多糖。給藥15d 后各組均腹腔注射80 mg/(kg·d)環(huán)磷酰胺，連續(xù)3 d，獲得DM 小鼠免疫力低下模型。各組小鼠均連續(xù)灌胃30 d。

1.3.3 耳腫脹法檢測(cè)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)

于給藥后第4 d，各組取8 只小鼠，硫化鋇腹部脫毛范圍約3 cm ×3 cm，在去毛部位均勻涂抹1%二硝基氟苯(DNFB)丙酮溶液50 μL/只致敏，次日同劑量加強(qiáng)1 次。于第30 d 末次給藥1 h 后，將1% DNFB 均勻涂抹于小鼠右耳10 μL/只，使局部產(chǎn)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(水腫)，24 h 后處死小鼠，用8 mm 打孔器打取兩耳相同部位的耳片，稱(chēng)質(zhì)量，以左右耳片質(zhì)量之差為腫脹度(mg)，腫脹度越大，提示反應(yīng)越強(qiáng)。

1.3.4 ELISA 法檢測(cè)小鼠血清IgM、IgG 與INF-γ含量

于末次給藥2 h 后，眼眶取血制備血清，用雙抗體夾心ELISA 法檢測(cè)血清中IgM、IgG 和INF-γ 的水平(嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作)。

1.3.5 碳粒廓清法測(cè)定非特異性免疫功能

上述小鼠尾靜脈注射經(jīng)稀釋的印度墨汁0.05 mL/10 g，于1、5 min 后，分別從眼眶靜脈取血20 μL加到0.1% Na2CO3溶液2 mL 中搖勻，于600 nm 處測(cè)定1 min(t1)和5 min(t5)的光密度(OD1 和OD5)，計(jì)算碳粒廓清指數(shù)K 和吞噬指數(shù)α 之后，將小鼠處死，取肝臟、脾臟及胸腺稱(chēng)重，計(jì)算其臟器系數(shù)。

1.3.6 脾淋巴細(xì)胞增殖率的測(cè)定

上述處死后小鼠在無(wú)菌條件下取脾，常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液［8］。在96 孔平底培養(yǎng)板每孔中分別加入100 μL 上述脾細(xì)胞懸液(終濃度為1 ×109/mL)與100 μL 濃度為5 μg/mL 的ConA，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，每孔加入10μL MTT 溶液(5 mg/mL)，再繼續(xù)培養(yǎng)12 h。取出培養(yǎng)板，2000 rpm 離心5 min，棄上清液，每孔加入100μL，二甲基亞砜(DMSO)，充分振蕩30 s 后，靜置20 min，于570 nm 處用酶標(biāo)儀進(jìn)行比色分析。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，應(yīng)用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，方差不齊時(shí)采用Tamhane's T2 法各組間比較采用單因素方差分析及LSD 檢驗(yàn)。P＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 LCA 藥物包封率與載藥量

獲得的APS 殼聚糖納米粒凍干粉表面蓬松，可溶性良好。平均包封率為(73.672±3.6)%，平均載藥量為(18.63±1.13)%。

2.2 LCA 對(duì)免疫力低下DM 小鼠DTH 的影響

由表1 可知，灌胃給藥30 d 后，免疫力低下DM小鼠不同劑量的LCA 與APS 耳腫脹度明顯高于模型組，差異具有顯著性(P＜0.05)。而APS 組耳腫脹度與低劑量LCA 組差異不顯著，中、高劑量組耳腫脹度均顯著高于A(yíng)PS 組。

表1 LCA 對(duì)免疫力低下DM 小鼠DTH 的影響(X±S，n=8)Table 1 Effect of LCA on DTH of diabetic mice (X±S，n=8)

2.3 LCA 對(duì)免疫力低下DM 小鼠血清IgM、IgG、INF-γ 分泌的影響

由表2 可知，與模型組相比，各劑量組和APS組均顯著促進(jìn)免疫力低下DM 小鼠血清IgM、IgG 的生成(P＜0.05)，顯著降低INF-γ 的分泌，低劑量組與APS 組差異均不顯著(P＞0.05)，中、高劑量組IgM、IgG 含量均顯著高于A(yíng)PS 組。

表2 LCA 對(duì)免疫力低下DM 小鼠血清IgM、IgG 與INF-γ 分泌的影響(X±S，n=8)Table 2 Effect of LCA on IgM，IgG and INF-γ levels of diabetic mice (X±S，n=8)

2.4 LCA 對(duì)免疫力低下DM 小鼠非特異性免疫功能的影響

由表3 可見(jiàn)，模型組小鼠廓清指數(shù)K 和吞噬指數(shù)α 相對(duì)LCA 低、中、高劑量組明顯降低(P＜0.05)。APS 組碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)明顯升高(P＜0.05)，但與LCA 低劑量組療效無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。中、高劑量組K、α 值均顯著高于A(yíng)PS組，提示LCA 明顯增強(qiáng)免疫低下小鼠非特異性免疫功能，且存在劑量負(fù)相關(guān)性。

表3 LCA 對(duì)DM 小鼠非特異性免疫功能的影響(X±S，n=8)Table 3 Effect of LCA on nonspecific immune function of diabetic mice (X±S，n=8)

2.5 LCA 對(duì)免疫力低下DM 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率

由表4 可知，灌胃給藥30 d 后，免疫力低下DM小鼠不同劑量的LCA 與APS 脾淋巴細(xì)胞增殖率均明顯高于模型組，差異具有顯著性(P＜0.05)。提示LCA 具有提高免疫力低下DM 小鼠的細(xì)胞免疫功能。

表4 LCA 對(duì)免疫力低下DM 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率的影響(X±S，n=8)Table 4 Effect of LCA on spleen lymphocyte proliferation rate of diabetic mice (X±S，n=8)

3 討論

機(jī)體的免疫功能低下不能有效的抵御外來(lái)感染，大量研究證實(shí)DM 患者免疫功能易發(fā)生改變，這可能是由于患者長(zhǎng)期處于高血糖狀態(tài)下，血細(xì)胞的趨化性、吞噬作用及殺菌能力降低，免疫力下降，易并發(fā)感染或是感染擴(kuò)散，引發(fā)如糖尿病足等并發(fā)癥，威脅著DM 患者的生命安全。因此，尋找安全、有效增強(qiáng)DM 患者免疫力的途徑是降低DM 并發(fā)癥的發(fā)生率，提高DM 患者生活質(zhì)量的重要方向。本文采用注射STZ 與環(huán)磷酰胺混合試劑建立DM 合并免疫力低下小鼠模型為研究對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)變化評(píng)價(jià)藥物調(diào)節(jié)DM 免疫力作用具有一定的學(xué)術(shù)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。

本研究黃芪多糖是由75%乙醇超聲輔助提取，復(fù)合藥物在灌胃前都均經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾后采用冷凍干燥法獲得，保證藥物的無(wú)菌性。經(jīng)以上數(shù)據(jù)，可知LCA 可提高免疫力低下DM 小鼠體液免疫與非特異性免疫功能，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖，改善DM 小鼠免疫紊亂現(xiàn)象，從而降低DM 小鼠的如并發(fā)感染等癥狀，提高DM 小鼠存活率。其免疫調(diào)節(jié)作用效果較黃芪多糖好，且具有控緩釋功效，為臨床治療DM 提供有效、無(wú)毒的輔助藥物。數(shù)據(jù)顯示本實(shí)驗(yàn)中的APS 組與低劑量組的各項(xiàng)指標(biāo)差異不明顯，可能與LCA 劑量有關(guān)，另外，諸多研究表明殼聚糖的生物功能與其分子量密切相關(guān)，因此，在后續(xù)研究中，通過(guò)酶量與反應(yīng)時(shí)間制備不同窄分子量的殼聚糖，將從分子量與載藥量等方面做進(jìn)一步的探索研究。

1 Geerlings SE，Hoepelman AI.Immune dysfunction in patients with diabetes mellitus (DM).FEMS Immunol Med Microbiol，1999，26:259-265.

2 Yuan SL，Piao XS，Li DF，et al.Effects of dietary astragalus polysaccharide on growth performance and immune function in weaned pigs.Animal Sci，2006，8:501-507.

3 Gao X(高旭)，Li LF(李麗芬)，Liu BY(劉斌鈺).Astragalus polysaccharide on the immune function of mice of experimental research.J Datong Univ(大同大學(xué)學(xué)報(bào))，2010，26(4):43-44.

4 Budhian A，Siegel SJ，Winey KI.Controlling the in vitro release profiles for a system of haloperidol-loaded PLGA nanoparticles.Int J Pharm，2008，346:151-159.

5 Chen LS(陳魯生)，Zhou W(周武)，Jiang YS(姜云生).殼聚糖粘均分子量的測(cè)定.Chemistry (化學(xué)通報(bào))，1996，4:57-58.

6 Wei TJ(魏譚軍)，Dong DG(董德剛)，Qiu L(裘梁).Prepared chitosan nanoparticles by ionic cross-linking.Anhui Agric Sci(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué))，2012，40:2885-2886.

7 Li XD (李孝棟)，Chen JS (陳景山)，Chen F (陳峰)，et al.Study on methodology for determination of polysaccharides of Astragalus Membranaceus.World Sci Technol/Mod Tradit Chin Med Mater Med，2006，8(2):35-37.

8 Tu SY(徐叔云).Pharmacological Experiment Methodology.Beijing:People's Medical Publishing House(人民衛(wèi)生出版社)，2001.1421-1441.