多糖的化學(xué)修飾對(duì)其生物活性影響研究進(jìn)展

孟思彤，徐艷芝，王振月*

1黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2 哈藥集團(tuán)三精制藥股份有限公司，哈爾濱 150040

多糖在自然界蘊(yùn)藏豐富，種類繁多，具有抗腫瘤、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等眾多生物活性且其副作用低而引起研究者廣泛關(guān)注并獲得很大進(jìn)展［1-3］，多糖生物活性的發(fā)揮與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，很多研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)化學(xué)修飾后多糖生物活性明顯增強(qiáng)或產(chǎn)生新的活性，在保持健康和預(yù)防疾病方面產(chǎn)生了極好的生理特性［4，5］，如天然香菇多糖具有抑制腫瘤的作用，而硫酸化后顯示出較高的抗HIV 的活性，因此多糖的分子修飾和結(jié)構(gòu)改造具有重要意義。本文對(duì)多糖化學(xué)修飾的常見方法硫酸化、磷酸化、乙?；⑼榛?、羧甲基化等及其對(duì)生物活性影響進(jìn)行闡述。

1 化學(xué)修飾方法

1.1 硫酸化

硫酸化修飾是多糖修飾中常見的方法之一，硫酸化的修飾方法主要有氯磺酸-吡啶法、濃硫酸法、三氧化硫-吡啶法等，其修飾結(jié)果是將硫酸基團(tuán)加到多糖的糖基上，增加其生物活性。研究表明，硫酸的取代度、取代位置、碳水化合物含量等對(duì)硫酸酯化多糖活性有一定影響。

1.2 磷酸化

多糖分子經(jīng)磷酸化修飾后，支鏈上的羥基被磷酸基團(tuán)取代，增強(qiáng)原多糖水溶性，改變鏈構(gòu)象，磷酸多糖衍生物有減輕心功能不全癥狀、抗炎、抗氧化、抗菌免疫、抗腫瘤等功能。

1.3 羧甲基化

羧甲基化是向多糖分子引入羧甲基，使部分生物活性受影響。大多數(shù)有生物活性的多糖都是水溶的，難溶水的一部分通常認(rèn)為沒用。提高多糖的水溶性是促進(jìn)多糖活性的很重要部分。廣泛認(rèn)為羧甲基化可以增加多糖的水溶性。

1.4 乙?；?/h3>

乙?；菍⒍嗵侵ф溕狭u基被乙?；鶊F(tuán)取代，使多糖結(jié)構(gòu)伸展，讓更多的羥基暴露出來，會(huì)導(dǎo)致它在水中的溶解度增加，提高其活性，是一種常用的多糖修飾方法。

1.5 烷基化

目前研究較多的是殼聚糖的烷基化，殼聚糖系甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物，這種高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等優(yōu)良性能被各行各業(yè)廣泛關(guān)注，烷基化的殼聚糖有極好的水溶性，有強(qiáng)溶菌酶降解和自身降解能力。對(duì)于制備水溶性好、可生物降解的殼聚糖衍生物有一定意義［6］。

1.6 硒化

硒化多糖是由硒和多糖組成，有雙重藥理作用，然而又不是兩種活性的簡單相加，硒化多糖會(huì)比它們產(chǎn)生更高或更新的活性。大量研究發(fā)現(xiàn)硒化多糖免疫增強(qiáng)活性與最佳硒化度的協(xié)同作用和碳水化合物含量有關(guān)。

2 生物活性影響

2.1 抗病毒活性

Yu Lu 采用CSA-Pyr 硫酸修飾法，這個(gè)方法中氯磺酸與吡啶濃度比、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度是重要影響因素，將三個(gè)因素加以考慮進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，得到9 種硫酸化淫羊藿多糖。結(jié)果證實(shí)硫酸化的淫羊藿多糖對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞抵抗雞傳染性法氏囊病毒感染的作用顯著增強(qiáng)，且其能力與硫酸基取代度和碳水化合物含量有一定的相關(guān)性［7］。較低濃度的硫酸化牛膝多糖與沒經(jīng)化學(xué)修飾的牛膝多糖比，硫酸化牛膝多糖(在MARC-145 細(xì)胞上)有顯著的抗豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的作用［8］。Tiehong Yang 等研究了硫酸化當(dāng)歸多糖APSs 在白血病病毒感染的小鼠體內(nèi)的活性，病毒復(fù)制被抑制，六種不同硫酸化程度的衍生物在濃度10～30 mg/kg 時(shí)抑制率從26%到30%。當(dāng)APS-1 在濃度為3～30 mg/kg 時(shí)，外周血細(xì)胞中CD4+細(xì)胞數(shù)量、CD4+/CD8+比值明顯增強(qiáng)，即加強(qiáng)了免疫功能。此外因感染病毒而減少的胸腺體重量指標(biāo)升高。這個(gè)類似患AIDS 的鼠模型與感染AIDS 的人類有很多相似的地方，如免疫缺陷、病毒復(fù)制、腫瘤發(fā)生。因此此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可適用于人類AIDS 研究上［9］。用MTT 法檢測兩種硫酸化銀耳多糖和三種沒經(jīng)過化學(xué)修飾的銀耳多糖對(duì)感染NDV 病毒細(xì)胞的效果，結(jié)果顯示硫酸化銀耳多糖明顯提高抗NDV 病毒能力［10］。Uryu 等最先將烷基引入到硫酸低聚糖，合成了如硫酸十八烷麥芽醇己糖苷、硫酸十二烷昆布戊糖苷和硫酸十二烷昆布寡聚物。發(fā)現(xiàn)烷基化修飾后的硫酸低聚糖的抗HIV 活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于修飾前的多糖［11］。大量實(shí)驗(yàn)證明了多糖衍生物抗病毒作用增強(qiáng)與化學(xué)集團(tuán)取代度有關(guān)，同時(shí)聚合度、基團(tuán)位置、聚合物骨干等結(jié)構(gòu)因素也會(huì)影響抗病毒活性，化學(xué)集團(tuán)的引入改變多糖三維構(gòu)象，從而影響其活性。

2.2 抗腫瘤活性

Wei 等合成了四種硫酸取代度不同的紅芪多糖，硫酸基團(tuán)主要修飾C-2 和C-6 位置。與紅芪多糖較低的效果相比，硫酸化的紅芪多糖在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)A549 細(xì)胞和BGC-823 細(xì)胞有更高的抑制率，表明硫酸化的紅芪多糖有更好的抗腫瘤活性。流式細(xì)胞術(shù)表明硫酸化紅芪多糖調(diào)節(jié)A549 和BGC-823細(xì)胞在G1 階段細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞增長及誘發(fā)細(xì)胞凋亡。且與常見治療癌癥的藥物不同，紅芪多糖和硫酸化的硫酸化多糖對(duì)非癌癥細(xì)胞HEK293均沒有細(xì)胞毒性作用［12］。將有獨(dú)特結(jié)構(gòu)–［3GlcAβ1-4 (GalNAcα1-3)-Fucα1］n 的烏賊墨多糖硫酸化，結(jié)構(gòu)變?yōu)楱C［3GlcAβ1-4 (4，6-SO4-GalNAcα1-3)-Fucα1］n–在體外肝癌細(xì)胞HepG2上產(chǎn)生劑量依賴的抑制細(xì)胞入侵和轉(zhuǎn)移作用。而且在雞胚尿囊膜模型中，明顯抑制血管新生［13］。硫酸化的脫脂米糠多糖在體外有明顯抑制B16 細(xì)胞和HepG2 細(xì)胞增長的作用。當(dāng)硫酸取代程度在0.81到1.29 范圍內(nèi)、碳水化合物含量在41.41%到78.56%之間時(shí)，其抗腫瘤作用相對(duì)較強(qiáng)［14］。磷酸化的茯苓(1→3)-β-D-葡聚糖在溶液中存在一個(gè)相對(duì)延伸柔性鏈。體外實(shí)驗(yàn)中有抗腫瘤活性，在體內(nèi)對(duì)S180細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制率，而茯苓葡聚糖則沒有這個(gè)生物活性?；蛟S是磷酸基團(tuán)、較高的分子質(zhì)量、相對(duì)擴(kuò)展的構(gòu)象增加與免疫細(xì)胞受體結(jié)合的機(jī)會(huì)，從而增強(qiáng)抗腫瘤活性［15］。將茯苓中β-(1→3)-D-葡聚糖(PCS3-II)羧甲基硫酸化后(CS-PCS3-II)，在溶液中有一條擴(kuò)展的柔性鏈。CS-PCS3-II 在老鼠體內(nèi)對(duì)S180腫瘤細(xì)胞抑制率比PCS3-II 有顯著提高，顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞有壞死和凋亡的跡象。免疫增強(qiáng)是因?yàn)榱蛩岷汪燃谆鶊F(tuán)通過結(jié)合氧、靜電吸引與免疫細(xì)胞受體接觸增多，達(dá)到一個(gè)更強(qiáng)大的免疫反應(yīng)，從而抑制腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散。此外，噬菌細(xì)胞、胸腺指標(biāo)、脾臟指標(biāo)都有顯著增多。溶血活性、脾臟抗體產(chǎn)生、遲發(fā)型超敏反應(yīng)表明在老鼠體內(nèi)CS-PCS3-II 能顯著增強(qiáng)免疫保護(hù)功能［16］。多糖的抗腫瘤活性與結(jié)構(gòu)有關(guān)，大量實(shí)驗(yàn)證明了許多多糖衍生物抗腫瘤作用增強(qiáng)，主要機(jī)制為抑制腫瘤細(xì)胞增長、誘發(fā)其凋亡、抑制其轉(zhuǎn)移和入侵等作用。

2.3 免疫作用

Junmin Wang 等將寧夏枸杞多糖硫酸化配合ND 免疫雛雞，在一免后28 d 內(nèi)能顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、增強(qiáng)血清抗體效價(jià)、加強(qiáng)免疫力［17］。硫酸化香菇多糖減少NDV 雛雞的發(fā)病率和死亡率，高劑量可增強(qiáng)抗體效價(jià)，低劑量促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖效果更好，比香菇多糖效果明顯。硫酸化香菇多糖可增加香菇多糖的佐劑性，提高NV 疫苗的免疫效力［18］。將三種硫酸取代度不同，其中碳水化合物含量、分子質(zhì)量、氯磺酸與吡啶濃度比均不同的硫酸化柿子多糖進(jìn)行體外脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明硫酸化多糖能促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生及NO 釋放，使脾淋巴細(xì)胞激活性顯著提高［19］。硫酸化多糖衍生物產(chǎn)生增強(qiáng)抗體效價(jià)、促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、提高淋巴細(xì)胞激活性等作用，使其免疫作用明顯增強(qiáng)。在注射新城疫病毒疫苗的雛雞體內(nèi)，硒化當(dāng)歸多糖與沒經(jīng)化學(xué)修飾的當(dāng)歸多糖相比可以明顯促進(jìn)周圍淋巴細(xì)胞增殖、增加血清抗體效價(jià)、IFN-γ、1L-6 含量。根據(jù)三個(gè)因素(Na2SeO3量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間)正交得到9 種硒化衍生物sCAPs，其中sCAP2 效力最強(qiáng)，可能與最佳的硒化程度和碳水化合物含量有關(guān)［20］。

2.4 抗氧化

硫酸化的柿子多糖有呈劑量依賴的還原反應(yīng)，DPPH 清除、超氧陰離子清除、羥基清除。三種柿子多糖衍生物(硫酸化取代度分別為0.8、1.7、2.5)中，硫酸化程度高的效果最好。硫酸根基團(tuán)使端基碳的氫原子活潑、增加多糖聚合電解質(zhì)和親核性、增加與金屬鐵的接觸，從而增強(qiáng)清除力。多糖的清除能力取決于其結(jié)構(gòu)參數(shù)，如分子質(zhì)量、水溶性、取代基團(tuán)、取代位置、取代程度、糖種類、糖苷分支。對(duì)這些條件進(jìn)行優(yōu)化也是增強(qiáng)多糖抗氧化力的途徑［21］。硫酸化白沙嵩多糖抗氧化提高，其機(jī)制可能是由于其強(qiáng)供氫能力、與金屬螯合能力、除超氧自由基效力。高硫酸取代度和適當(dāng)?shù)姆肿淤|(zhì)量能加強(qiáng)其抗氧化性［22］。黑木耳作為藥物食物有1000 多年，有很多生物活性。黑木耳粗多糖水溶性差，很難純化及進(jìn)一步研究。但羧甲基化的黑木耳多糖水溶性增強(qiáng)，其氧化性與黑木耳粗多糖相比增強(qiáng)，如羥基消除、DPPH 自由基消除和ABTS +自由基消除，特別是后兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，氧化性幾乎為沒經(jīng)化學(xué)修飾的黑木耳多糖的兩倍［23］。靈芝多糖羧甲基化增加了其水溶性，而且還發(fā)現(xiàn)了它有很高的氧化性，特別是清除羥基自由基、過氧化氫，一定程度上清除超氧陰離子團(tuán)。而靈芝多糖的這些活性表現(xiàn)的很微弱［24］。乙?；瞎隙嗵窃贒PPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)、超氧陰離子自由基活性測定實(shí)驗(yàn)、還原能力測定實(shí)驗(yàn)中都顯示出比南瓜多糖更高的氧化性，且其氧化能力和取代度有很大關(guān)系，可能結(jié)構(gòu)參數(shù)取代度、分子量不同而導(dǎo)致不同的抗氧化性，該實(shí)驗(yàn)加入吡啶催化劑可以增加取代度，而酸酐量幾乎沒有影響。南瓜多糖及其乙?；苌锒伎梢种七^氧化氫誘導(dǎo)小鼠胸腺淋巴細(xì)胞的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡，乙?；瞎隙嗵潜憩F(xiàn)出更好的防護(hù)作用。在體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)都說明了乙?；瞎隙嗵怯休^強(qiáng)的抗氧化性［25］。然而Shao 從裂片石莼中分離的四種硫酸多糖抗氧化性差異表現(xiàn)和很多實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，兩種硫酸含量低的多糖氧化性高于另兩種硫酸含量高的多糖。也許是裂片石莼多糖抗氧化活性不是一個(gè)因素決定的，而是由幾個(gè)因素共同決定:如分子質(zhì)量、糖醛酸含量、蛋白質(zhì)含量［26］。分析實(shí)驗(yàn)不同結(jié)果可見，多糖抗氧化力并不是一個(gè)因素決定的，而是由多因素共同決定。研究不同多糖抗氧化作用機(jī)制，優(yōu)化硫酸化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件，找到合適的硫酸化衍生物，對(duì)研究其性能優(yōu)勢至關(guān)重要。

2.5 抗凝血作用

肝素是迄今為止使用時(shí)間最長的硫酸多糖。通常，硫酸化多糖有抗凝血作用是因?yàn)楹透嗡赜邢嗨频慕Y(jié)構(gòu)和抗凝血機(jī)制一致。盡管肝素已經(jīng)廣泛用于抗凝血治療60 多年，但它在臨床應(yīng)用上有很多問題，比如對(duì)抗凝血酶不足病人無效，生物利用度低，出血的風(fēng)險(xiǎn)以及在一些肝素接受者身上引起的血小板減少癥［27-30］。近年來根據(jù)肝素抗凝血機(jī)理制備的低副作用硫酸化多糖受到廣泛關(guān)注。Lihong Fan首次采用三磺化十二胺作為硫酸化試劑在水溶液中制備蘋果果膠硫酸鹽。果膠硫酸鹽能通過抑制抗凝血酶延長部分凝血活酶時(shí)間和凝血酶時(shí)間［31］。硫酸多糖衍生物的制備與探尋為尋找新的副作用更小的抗凝血藥物有很大意義。

2.6 抗炎

硫酸黃芪多糖劑量依賴的上調(diào)緊密蛋白如閉合蛋白、ZO-1 的mRNA 表達(dá)，下調(diào)促炎因素如TNF-α、1L-1β、1L-8 的mRNA 表達(dá)，保護(hù)了LPS 感染的Caco2 細(xì)胞。體外研究表明硫酸化的黃芪多糖抗炎效果優(yōu)于黃芪多糖［32］。

2.7 降血脂作用

硫酸化孔石莼多糖與孔石莼多糖相比，前者使小鼠體內(nèi)的甘油三酸酯、低密度脂蛋白濃度明顯下降［28.1%(P＜0.05)和28.4%(P＜0.01)］。結(jié)果顯示硫酸化孔石莼多糖有更高的抗高血脂效果且降血脂活性沒有濃度依賴。作用機(jī)制尚不明確，前期研究表明硫酸化孔石莼多糖比石莼多糖有更高的抗氧化性，其降血脂活性可能與抗氧化活性有關(guān)［33］。

3 小結(jié)

多糖的生物活性大多與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，多糖主鏈各糖單元組成、糖苷鍵類型均直接決定了多糖的活性，多糖支鏈的類型、聚合度、支鏈在多糖鏈上的分布及其取代度決定了多糖的活性大小，同時(shí)多糖生物活性很大程度取決于其分子質(zhì)量，多糖分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)如鏈的柔韌性和空間構(gòu)象與多糖活性緊密相關(guān)，為提高多糖的生物活性，多糖的分子修飾和結(jié)構(gòu)改造具有重要意義。利用化學(xué)修飾法向多糖中引入新的基團(tuán)從而增加或增強(qiáng)多糖的生物活性，且多糖類化合物大多沒有毒性，使多糖及其衍生物在功能食品、藥品、藥妝領(lǐng)域等方面有更大的開發(fā)潛力。隨著多糖結(jié)構(gòu)修飾方法的完善、科學(xué)技術(shù)水平不斷提高以及生命學(xué)科等領(lǐng)域的發(fā)展，多糖以及多糖衍生物的研究將會(huì)不斷深入，科研工作者將會(huì)開發(fā)出更多更好的多糖類化合物，從而使糖化學(xué)研究運(yùn)用到人類生活中。

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