大金發(fā)蘚化學(xué)成分預(yù)試及其腫瘤細(xì)胞毒活性研究

成曉霞，張志琪，湯 薇，王亞芹，袁文娟，肖婭萍，3*

1藥用植物資源與天然藥物化學(xué)教育部重點實驗室;2 陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，西安 710062;3陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，西安 712046

大金發(fā)蘚Polytrichum commune L.ex Hedw.為金發(fā)蘚科Polytrichaceae、金發(fā)蘚屬Polytrichum 植物，又名獨(dú)根草、土馬鬃、巖上小草等，生于林下濕地，常形成大片群落覆蓋地面，廣泛分布于我國南北各地［1，2］。大金發(fā)蘚作為藥用苔蘚最早出現(xiàn)在宋代的《嘉祐補(bǔ)注本草》中，《本草綱目》及《中華本草》對其藥性描述為全草入藥，味甘，性涼。能滋陰清熱，涼血止汗，氣味甘浚，無毒。對高夫克氏球菌、金色葡萄菌、肺炎球菌、結(jié)核桿菌有抗性，并對淋巴細(xì)胞白血病等癌癥有一定抑制作用［3，4］。近年來陸續(xù)有報道稱從檜葉金發(fā)蘚Polytrichum juniperum，多形金發(fā)蘚Polytrichum ohioense Ren＆Card 和變形金發(fā)蘚Polytrichum pallidisetum Funck 中分離得到一系列新化合物并初步驗證其具有抗癌活性［5-7］。因此，本文對大金發(fā)蘚的化學(xué)成分和抗腫瘤作用進(jìn)行初步探究，以期為金發(fā)蘚屬植物藥用價值的開發(fā)應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 植物樣品

大金發(fā)蘚地上全草于2009年8 月采自陜西秦嶺南麓平河梁(海拔2305 m，33°27' N，108°30' E)，經(jīng)陜西師范大學(xué)肖婭萍教授鑒定為金發(fā)蘚屬大金發(fā)蘚Polytrichum commune L.ex Hedw。

1.2 供試腫瘤細(xì)胞

L1210 小鼠淋巴白血病細(xì)胞，人乳腺癌MDAMB-231、MCF-7 細(xì)胞，人食管癌Eca-109 細(xì)胞，人結(jié)直腸癌SW-480、SW-620 細(xì)胞，人胚腎細(xì)胞HEK-293，均由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心引進(jìn)，本室傳代保種。K562 人慢性髓系白血病細(xì)胞和U937 人急性單核白血病細(xì)胞由中國北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)引進(jìn)，本室傳代保種。以上腫瘤細(xì)胞均按照美國模式菌種收集中心(ATCC)提供方法進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 主要試劑

DMEM、PRMI1640、L-15 和馬血清均購自Gibco公司，胎牛血清(Hyclone 公司)，谷氨酰胺(Amresco公司)，超純水(Millipore 公司)，二甲基亞砜(DMSO)和噻唑藍(lán)(MTT)均購自Sigma 公司，化學(xué)成分預(yù)試所用試劑均為國產(chǎn)分析純，自配。

1.4 主要儀器

萬分之一電子天平(塞多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)，KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，HH-6B 數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)，生物材料粉碎機(jī)，超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo 公司)，倒置顯微鏡(IMT-2，Olympus 公司)，臺式高速離心機(jī)(Eppendorf 公司)，高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)，酶標(biāo)儀(型號BIO-TEK-ELX800，Tecan 公司)，96 孔培養(yǎng)板(Costar 公司)。

1.5 大金發(fā)蘚化學(xué)成分預(yù)試驗

按照植物化學(xué)成分系統(tǒng)預(yù)試的常規(guī)方法［8］進(jìn)行大金發(fā)蘚石油醚提取液、水提取液及乙醇提取液的制備，通過傳統(tǒng)試管預(yù)試方法結(jié)合紙色譜法進(jìn)行揮發(fā)油、油脂、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、皂苷、生物堿、黃酮、蒽醌、香豆素、木質(zhì)素等化學(xué)成分的檢測。

1.6 大金發(fā)蘚提取物制備

收集大金發(fā)蘚全株，制備成粉末，用乙醇結(jié)合超聲提取，30 min/次，共計3 次，收集合并提取液，減壓濃縮后通過真空冷凍干燥得大金發(fā)蘚乙醇提取物(Ethanol extract from Polytrichum commune L.ex Hedw，EPCLH)。將EPCLH 溶解于70% 乙醇，室溫條件下3 000 rpm 離心15 min，取上清液用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行抗癌活性檢測［9］。

1.7 大金發(fā)蘚腫瘤細(xì)胞毒活性檢測

細(xì)胞存活率采用MTT 法進(jìn)行檢測［9］。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，以1 ×105個/mL 接種于96 孔板中培養(yǎng)。實驗分為空白對照組、陰性對照組(70%乙醇)、陽性對照組(0.5 μg/mL 紫杉醇)和給藥組(EPCLH)，細(xì)胞加藥后連續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加入5 g/L 的無菌MTT 溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去各孔培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，200 rpm搖床震蕩10 min，待完全溶解后用酶標(biāo)儀測定570 nm 吸光度(A)，校正波長為630 nm。每組設(shè)6 個復(fù)孔，實驗重復(fù)3 次。細(xì)胞存活率=A加藥組/ A對照組×100%。結(jié)合藥物的作用劑量，推算出藥物對腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50，以此衡量藥物的抗癌活性。

1.8 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)均以Mean±SD 進(jìn)行表示。采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。藥物濃度與細(xì)胞生長抑制率的關(guān)系用線性回歸與相關(guān)分析，組間比較使用T-test。

2 結(jié)果與分析

2.1 大金發(fā)蘚化學(xué)成分預(yù)試驗結(jié)果

大金發(fā)蘚石油醚提取液、水提取液及乙醇提取液的化學(xué)成分預(yù)試結(jié)果(表1)表明，大金發(fā)蘚中含有揮發(fā)油或油脂、糖類、皂苷、生物堿、黃酮、香豆素及其萜類內(nèi)酯化合物，無法確定是否存在蛋白質(zhì)、氨基酸、蒽醌及木質(zhì)素類化合物。

表1 大金發(fā)蘚化學(xué)成分系統(tǒng)預(yù)試驗結(jié)果Table 1 Systematic pre-test results on chemical composition of P.commune

2.2 大金發(fā)蘚提取物制備結(jié)果

大金發(fā)蘚300 g 經(jīng)乙醇提取后得浸膏16.7 g，計算得率為5.57%。大金發(fā)蘚孢子體(J-BZ)100 g經(jīng)乙醇提取后得浸膏8.73 g，計算得率為8.73%。大金發(fā)蘚配子體(J-PZ)300 g 經(jīng)乙醇提取后得浸膏9.33 g，計算得率為3.11%。結(jié)果提示大金發(fā)蘚孢子體中化學(xué)物質(zhì)種類和含量均有可能高于其配子體。

2.3 大金發(fā)蘚抗腫瘤活性分析

2.3.1 大金發(fā)蘚乙醇提取物抑制腫瘤細(xì)胞增殖及對正常細(xì)胞生長的影響

將大金發(fā)蘚乙醇提取物(EPCLH)分別與表2所列的腫瘤細(xì)胞在實驗條件下共孵育，結(jié)果顯示，作用24 h 后，120 μg/mL 的EPCLH 能將L1210 細(xì)胞的存活率降至30%以下。相同劑量作用下，MDAMB-231 和MCF-7 細(xì)胞的增殖能力也受到一定抑制，但作用48 h 后仍未能使細(xì)胞存活率降至50%以下。EPCLH 對食管癌細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞生長的影響明顯低于其對白血病細(xì)胞的毒性作用。以上結(jié)果提示，L1210 白血病細(xì)胞對EPCLH 的毒性作用較為敏感。

表2 大金發(fā)蘚乙醇提取物抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性(n=6，)Table 2 Anti-tumor activity of P.commune ethanol extract (n=6，)

表2 大金發(fā)蘚乙醇提取物抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性(n=6，)Table 2 Anti-tumor activity of P.commune ethanol extract (n=6，)

為進(jìn)一步驗證EPCLH 的細(xì)胞毒活性，本實驗比較了其對L1210 細(xì)胞和HEK 293 細(xì)胞生長的影響，同時以紫杉醇(0.5 μg/mL)作為陽性對照。結(jié)果如圖1 所示，EPCLH 可明顯抑制L1210 細(xì)胞的增殖，且具有劑量依賴效應(yīng)。當(dāng)藥物作用24 h 后，隨著藥物劑量由30 μg/mL 增加到120 μg/mL，細(xì)胞存活率則由82.91%下降至26.99%，此時的半數(shù)抑制濃度(IC50)為77.22 μg/mL。與對照組相比，30 μg/mL的EPCLH 即可對L1210 細(xì)胞的生長產(chǎn)生抑制作用(P＜0.05)，當(dāng)藥物劑量由60 μg/mL 增加至120 μg/mL 時，抑制作用愈發(fā)明顯(P＜0.01)。而相同實驗條件下，紫杉醇對細(xì)胞的抑制率僅為20%，與90 μg/mL 的EPCLH 相比差異極顯著(P＜0.01)。此外，EPCLH 對L1210 細(xì)胞和HEK-293 細(xì)胞的生長影響差異極顯著(P＜0.01)，相同劑量的EPCLH 能夠顯著降低L1210 白血病細(xì)胞存活率的同時對HEK-293 人胚腎細(xì)胞的生長不產(chǎn)生明顯影響。

圖1 大金發(fā)蘚乙醇提取物對L1210 細(xì)胞和HEK-293 細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.1 Cytotoxicity effect of EPCLH on L1210 cells and HEK-293 cells

2.3.2 大金發(fā)蘚孢子體與配子體對白血病細(xì)胞毒性的比較

植物在不同生長時期所含化學(xué)物質(zhì)的種類及含量也略有變化，以體外培養(yǎng)的白血病細(xì)胞為實驗?zāi)Ｐ?，對大金發(fā)蘚的孢子體(J-BZ)與配子體(J-PZ)的乙醇提取物進(jìn)行抗腫瘤活性檢測。將相同劑量的J-BZ與J-PZ 分別加入L1210 細(xì)胞、K562 細(xì)胞及U937 細(xì)胞，共孵育24、48、72 h，比較分析三種白血病細(xì)胞在兩種提取物的干預(yù)下相對存活率的變化，結(jié)果見圖2。

J-BZ 能夠在作用24 h 即對K562 細(xì)胞的生長造成影響，當(dāng)作用劑量為80 μg/mL 時，細(xì)胞生長被抑制，細(xì)胞存活率降至50%左右，當(dāng)藥物濃度增至120 μg/mL，細(xì)胞存活率低于20%(Fig.2A)。相同條件下，當(dāng)J-PZ 的濃度為160 μg/mL 才能使細(xì)胞存活率降至20%以下(Fig.2B)。整體看來，J-BZ 與J-PZ均能對K562 細(xì)胞的增殖起到抑制作用，但處理相同時間后(24 h)，二者表現(xiàn)出的抗腫瘤能力大小卻明顯不同，低劑量時差異極顯著(P＜0.01)，當(dāng)細(xì)胞存活率降至20%以下，二者差異顯著(P＜0.05)(Fig.2C)。

當(dāng)?shù)葎┝康腏-BZ 與J-PZ 作用于L1210 細(xì)胞時，結(jié)果如圖2D～F 所示，二者對細(xì)胞生長的影響在48 h 表現(xiàn)最明顯。當(dāng)藥物濃度為80 μg/mL 時，J-BZ 與J-PZ 作用下的細(xì)胞存活率分別為47% 和70%;藥物濃度增至120 μg/mL，J-BZ 可使細(xì)胞存活率降至20%以下，而J-PZ 處理后的細(xì)胞存活率為40%;160 μg/mL 的J-BZ 已使得細(xì)胞幾乎不再生長，同劑量的J-PZ 此時將細(xì)胞存活率保持在20%左右。當(dāng)J-BZ 與J-PZ 的作用劑量大于200 μg/mL后，細(xì)胞幾無存活。因此，就200 μg/mL 以下的三種藥物濃度對L1210 小鼠白血病細(xì)胞的存活影響力而言，大金發(fā)蘚孢子體明顯優(yōu)于其配子體(P＜0.01)。

圖2 大金發(fā)蘚孢子體與配子體對白血病細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Cytotoxicity effect of sporophyte and gametophyte on leukemia cells

在U937 細(xì)胞的生長過程中加入等濃度的J-BZ與J-PZ，二者均表現(xiàn)出明顯的時間、劑量依賴性。當(dāng)J-BZ 與細(xì)胞共孵育72 h，隨著藥物濃度由80 μg/mL 增至120、160 μg/mL 后，細(xì)胞存活率依次降為65%、30%、15%(Fig.2G)。相同的作用時間內(nèi)，80 μg/mL 的J-PZ 幾乎未對細(xì)胞的生長造成影響，當(dāng)藥物劑量為160 μg/mL，細(xì)胞存活率保持在60%左右，直至藥物濃度達(dá)到240 μg/mL，細(xì)胞存活率才下降至20%(Fig.2H)。比較分析二者對細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示在80～240 μg/mL 的劑量范圍內(nèi)，大金發(fā)蘚孢子體對U937 人急性粒細(xì)胞白血病的增殖抑制能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于其配子體(P＜0.01)(Fig.2K)。

3 討論

大金發(fā)蘚因具有藥用價值被歷代藥用典籍記載，近代學(xué)者對其化學(xué)成分進(jìn)行研究，指出其中主要含二氧雜環(huán)己烷木質(zhì)素，苯酚類化合物，甾醇酯類，蠟酯類，植醇酯，葉綠素，花生四烯酸，單糖基二甘油酯類，雙糖基二甘油酯類和脂類等［10-12］。本文對采自秦嶺南麓的大金發(fā)蘚化學(xué)成分進(jìn)行初步研究，部分結(jié)果與文獻(xiàn)描述一致，同時確定大金發(fā)蘚中還存在生物堿、黃酮和皂苷類化合物。

對金發(fā)蘚屬的其他植物研究顯示，檜葉金發(fā)蘚的乙醇及酸提取物能使小鼠sarcoma 37 肉瘤壞死［5］;多形金發(fā)蘚和變形金發(fā)蘚中分離得到的8 種新型苯并萘并呫噸酮類化合物(benzonaphthoxanthenones)和2 種新結(jié)構(gòu)的聯(lián)芐并苯乙烯醛基(cinnamoyl bibenzyls)化合物對9PS 小鼠白血病細(xì)胞和多種人類腫瘤細(xì)胞(A-549 肺癌、MCF-7 乳腺癌、HT-29 結(jié)腸癌、RPMI-7951 黑色素瘤和U-251 膠質(zhì)瘤)均表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，其中對白血病細(xì)胞的殺傷效應(yīng)最為顯著［6，7］。此外，在1977年《本草綱目》(校點本)中也記載大金發(fā)蘚對淋巴細(xì)胞白血病具有一定抑制作用［3］。根據(jù)同屬植物化學(xué)成分種類相近的規(guī)律推測，大金發(fā)蘚中存在抗腫瘤化合物的可能性極大。這一推論在2009年被傅芃等人的研究結(jié)果證實，從大金發(fā)蘚中分離得到的2 種新化合物(S，E)-5-苯乙烯基-7-羥基二氫黃酮(communin B)和苯并萘并呫噸酮衍生物(ohioensin F)均能抑制A-549人肺癌腫瘤細(xì)胞株、LOVO 人腸癌細(xì)胞株、MDA-MB-435 人乳腺癌細(xì)胞株、HepG2 人肝癌細(xì)胞株和6TCEM 人T 細(xì)胞白血病細(xì)胞的增殖，其中，6T-CEM 人T 細(xì)胞白血病細(xì)胞對藥物處理最為敏感［12］。本文結(jié)果同樣證明大金發(fā)蘚乙醇提取物能夠?qū)Π籽〖?xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞、人鼻咽癌細(xì)胞、人結(jié)直腸癌細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤活性，其中對白血病細(xì)胞的殺傷效應(yīng)最強(qiáng)，這與已有文獻(xiàn)結(jié)果相符。同時，實驗結(jié)果顯示對L1210 白血病細(xì)胞產(chǎn)生明顯增殖抑制作用的藥物劑量卻未對正常細(xì)胞的生長產(chǎn)生影響，以上研究結(jié)果提示，大金發(fā)蘚在抗腫瘤特別是白血病治療中具有潛在應(yīng)用價值。

苔蘚植物的生活史表現(xiàn)為配子體和孢子體的世代交替，其中配子體為具有單倍數(shù)染色體的小型綠色自養(yǎng)植物，而孢子體寄生于配子體上，通過基足攝取配子體的營養(yǎng)供給，保證具有2 倍數(shù)染色體的孢子正常發(fā)育。在生長過程中為抵御外界環(huán)境帶來的侵害而保證自身發(fā)育的需要，植物常常會產(chǎn)生并積累一些次生代謝產(chǎn)物，而這些次生代謝產(chǎn)物常具有重要的生理活性［13］。本文對大金發(fā)蘚進(jìn)行有效成分提取的過程中發(fā)現(xiàn)其孢子體提取物得率大于配子體，推測孢子體中化學(xué)物質(zhì)種類和含量均有可能高于其配子體，從而導(dǎo)致二者具有不同的生理活性。以體外培養(yǎng)的白血病細(xì)胞為考察對象的實驗結(jié)果證實了大金發(fā)蘚孢子體的抗腫瘤活性遠(yuǎn)優(yōu)于其配子體。根據(jù)植物次生代謝物質(zhì)生成規(guī)律結(jié)合苔蘚植物生活史推測，可能在大金發(fā)蘚孢子體形成過程中產(chǎn)生了一些特別的化學(xué)物質(zhì)，并潴留于孢子體中，使得大金發(fā)蘚孢子體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的種類及含量與其配子體內(nèi)略有不同，導(dǎo)致二者表現(xiàn)出的生理活性差異顯著。對其他植物類似的研究結(jié)果也表明，同一植物不同生長部位有效成分含量差異顯著。此外，藥典收錄同一種植物的不同部位記載為不同藥物的依據(jù)也是基于入藥部位所含化學(xué)成分種類的不同。若要明確大金發(fā)蘚孢子體及配子體抗腫瘤活性的差異，還有待于對其化學(xué)成分的進(jìn)一步研究，用實驗數(shù)據(jù)來佐證推論。

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