氨肽酶及其抑制劑的構(gòu)效關(guān)系

摘要：氨肽酶（APN/CD13；gp150）是一種鋅離子依賴型的外肽酶，廣泛分布于各種組織和細胞表面，并且在各種腫瘤細胞表面高表達，參與了腫瘤細胞的增殖，粘附，轉(zhuǎn)移，血管生成和腫瘤侵襲等過程。因此，氨肽酶被作為腫瘤治療中的重要靶點之一。目前，許多課題組通過計算機輔助藥物設(shè)計出了許多高效且選擇性高的化合物。本文通過介紹惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移闡述氨肽酶的作用機制，并對氨肽酶的天然抑制劑和化合物抑制劑及其構(gòu)效關(guān)系進行綜述。

關(guān)鍵詞：氨肽酶；氨肽酶 惡性腫瘤引起的死亡率僅次于腦血管疾病，位居世界第二。惡性腫瘤死亡率高居不下是由于其轉(zhuǎn)移和侵襲的生物特征。氨肽酶，又稱CD13抗體，是M1家族的一種多功能蛋白，本身具有催化活性中心，是細胞膜或組織表面的鋅離子依賴型的金屬蛋白酶。氨肽酶本身具有很強的輸水結(jié)構(gòu)域，在很多組織及器官中廣泛分布，主要表達是在肝，腸，腎臟的單核細胞，上皮細胞中，尤其是在腫瘤細胞表面表達較高[1]，并且氨肽酶在腫瘤脈管系統(tǒng)中的內(nèi)皮的表達明顯高于正常血管[2]，同時在不同腫瘤中APN的作用及其表達又有一定的差別[3]。APN分布廣泛，其生物學(xué)功能較為復(fù)雜，在不同的組織中呈現(xiàn)出不同的功能。氨肽酶在腫瘤細胞表面大量表達，可水解肽、酰胺等結(jié)構(gòu)中的酰胺鍵，從而釋放出不同的N端中性氨基酸。同時，APN還可以調(diào)節(jié)與惡性腫瘤相關(guān)的肽，從而調(diào)節(jié)惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移，分化，增殖，凋亡，以及血管生成等等[3]。

1 APN的催化機制

目前， APN的詳細作用機制尚不明確，但是有研究表明，APN的作用與mTOR/HIF-1α信號通路有關(guān)。Luke H. Stockwin等人，通過對缺氧條件下的黑色素瘤細胞質(zhì)膜上的蛋白表達進行研究，確定了在低氧條件下，HIF-1α和APN的表達均提高[4]。Schmitt等人，在研究APN抑制劑的時候發(fā)現(xiàn)，當(dāng)APN表達降低的時候，HIF-1α的表達量同時降低，進一步證實了這一觀點[5]。

雖然APN的詳細作用機制尚不明確，但是對其催化機制目前已經(jīng)有了相當(dāng)程度的認識。了解APN的催化機制對設(shè)計出更加有效更加合理的APN抑制劑是至關(guān)重要的。因此，已經(jīng)有大量課題組研究了APN的底物及其過度狀態(tài)，以及活性位點，催化位點的3D結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了APN的催化位點有金屬離子（鋅離子）存在于其親水結(jié)構(gòu)中，并且鋅離子在APN的催化過程中起到至關(guān)重要的作用。此外，APN活性中心附近的氨基酸的側(cè)鏈可以作為配基，利用氫鍵和周圍的殘基相連，這可能是為了降低連接中的熵值，使結(jié)合更加穩(wěn)定。在催化過程中，鋅離子可能起到兩種作用[6]。

圖1 鋅離子在APN催化機制中的作用：穩(wěn)定高活性的羥基（機制A），絡(luò)合氧原子促進水分子的親核攻擊（機制B）

首先：鋅離子可以固定高活性的羥基，從而確保在合適的PH條件下激活親核試劑的催化活性。其次，帶點的鋅離子可以作為親電催化劑絡(luò)合易斷開的肽鏈中的氧原子，從而促進水分子中親核部分的攻擊。也有學(xué)者猜測，APN活性位點的谷氨酸鹽作為親核試劑，起催化作用。或者酶有含雙核的金屬中心，羰基氧原子作為親核試劑協(xié)調(diào)其中一個或者兩個金屬與羥基的連接，但這兩種可能性與前面兩個相比較低。

2氨肽酶抑制劑

目前氨肽酶的抑制劑主要分為兩大類， 一種是從天然產(chǎn)物中發(fā)酵或直接提取獲得的，另一種是通過化學(xué)合成的方法得到有較高效價的化合物。

最早的APN天然抑制劑Bestatin是1976年由日本著名的抗生素研究者梅澤濱夫等人從橄欖網(wǎng)狀鏈球菌培養(yǎng)液中分離而得的[7]。但是由于Bestatin是在天然產(chǎn)物中提取的，手性中心不止一個，人工合成較難，限制了其大量應(yīng)用。而且Bestatin至少可以抑制氨肽酶家族12 種不同的亞型[8]，選擇性抑制較差，而在腫瘤治療領(lǐng)域，需要有較大效能和一定選擇性的抑制劑。因此，開發(fā)出有高選擇性和強抑制作用的氨肽酶抑制劑具有重大意義。

近年來，隨著APN抑制劑的需求量增加，化學(xué)合成的APN抑制劑以其抑制活性高，選擇性強，生物利用度高，藥效時間長等優(yōu)勢，逐漸被許多專家和學(xué)者重視。氨肽酶的小分子化合物抑制劑的研究得到了飛速的發(fā)展，其中涉及到的種類很多。但是這些化合物的效價及選擇性有待提高，且生物實驗數(shù)據(jù)有待明確，所以越來越多的氨肽酶抑制劑的設(shè)計及篩選都將重心轉(zhuǎn)到已知化合物的改進和修飾上來。

2.1新二氫吲哚-2，3-二酮衍生物 Kang Jin等人通過建立化學(xué)數(shù)據(jù)庫、對接虛擬篩選和進一步的活性分析，篩選出對氨肽酶抑制活性較強的化合物10c。以10c為先導(dǎo)化合物，設(shè)計一系列的二氫吲哚-2，3-二酮衍生物，作為APN 的抑制劑，初步顯示，圖2中X基團為氯原子的時候?qū)Π彪拿赣凶顑?yōu)的抑制活性（IC50=0.074±0.0026μM）[9]。

圖2 化合物10c及其衍生物的結(jié)構(gòu)

將X位點分別用氫，鹵素，甲基等取代，結(jié)果顯示，在該位點取代相關(guān)基團可以提高原化合物的活力，并且不同的鹵素在該位置取代時，對活力的影響也有所不同。氯取代的化合物活性強于溴取代的，氟取代的最弱。除了鹵素之外，甲基取代的化合物與未被取代的相比效能較高，但是仍然比Bestatin，和氯，溴的衍生物弱。同時，含異羥肟酸的側(cè)鏈必須有一定長度，延長側(cè)鏈會降低活性。另外，體外實驗顯示，含5～7個元素成環(huán)的縮酮的結(jié)構(gòu)的化合物，在其吲哚骨架結(jié)構(gòu)的3位上取代，得到的化合物有較強的活性。體外實驗該化合物對ES-2（人卵巢癌細胞，APN高表達）和MDA-MB-231（人乳腺癌細胞）的抑制作用較陽性藥Bestatin更強。

2.2苯丙環(huán)庚酮類似物 Céline Schmitt等人設(shè)計了一系列的7-氨基-苯丙環(huán)庚酮衍生物（7-amino-benzocycloheptan-6-one derivatives）（圖3），作為新的氨肽酶選擇性抑制劑的前體結(jié)構(gòu)[5]。從中選擇了三種具有不同Ki值的衍生物，建立相應(yīng)的構(gòu)效關(guān)系（SAR），從而確定了化合物的作用靶點為氨肽酶。同時，做了一系列的體外實驗如：酶活實驗，血管生成實驗室，細胞毒性實驗，管腔形成實驗等，評估了APN的生物學(xué)活性。

結(jié)果顯示，苯丙環(huán)庚酮類似物作為APN抑制劑，在毫摩爾到子納摩爾之間都具有高效抑制活性和高選擇性作用。體外實驗中，實驗組內(nèi)皮細胞的形態(tài)和運動均被抑制，在基質(zhì)膠上觀察到管腔形成明顯被抑制，且抑制作用強度與化合物濃度成正比。對于內(nèi)皮細胞而言，抑制劑的抗腫瘤活性取決于細胞表面APN的表達。體內(nèi)實驗中，給裸鼠靜脈注射最大耐受劑量的苯丙庚酮類似物，在29d內(nèi)，注射化合物的裸鼠與陰性組相比未出現(xiàn)明顯變化，可以認定裸鼠可耐受化合物，表現(xiàn)為無毒性作用。

另外，有文獻報道以7-氨基-苯丙環(huán)庚酮衍生物作為骨架結(jié)構(gòu)進行修飾，結(jié)果顯示五位取代外消旋的

圖3 新苯丙環(huán)庚酮衍生物結(jié)構(gòu)

苯丙環(huán)庚酮也有較強的氨肽酶抑制作用。在實驗過程中，還意外的發(fā)現(xiàn)，五位硫代的化合物能更有效的對鋅離子活性位點的抑制效能[10]。一位溴代，四位修飾苯基的苯丙環(huán)庚酮類似物與Bestatin相比具有較高的效能，且合成步驟簡單，可大規(guī)模合成[11]。

2.3環(huán)狀酰亞胺衍生物 Shu-Xiang Cui等人[12]，針對氨肽酶的活性口袋中的有助于腫瘤增殖的部分，設(shè)計出結(jié)合活性口袋中S1和S'1位點的環(huán)酰亞胺類似肽（CIP-13F）（圖4），選用氨肽酶高表達的人卵巢癌細胞ES-2和氨肽酶低表達的HRA細胞系進行實驗。實驗結(jié)果顯示，CIP-13F可以有效的抑制ES-2細胞的增殖和遷移，同時，對HRA細胞沒有明顯的抑制作用，這說明合成的環(huán)酰亞胺類似肽具有較高的選擇性，這點被進一步用流式細胞實驗和Westen Blot實驗所證實。活體實驗中，對荷瘤鼠進行尾靜脈注射治療，可以發(fā)現(xiàn)與對照組相比，腫瘤大小有明顯的降低。

圖4 CIP-13F的結(jié)構(gòu)

4氨肽酶的發(fā)展和展望

氨肽酶作為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的靶點，其抑制劑的研究已經(jīng)取得了十足的進展，在此基礎(chǔ)上，對有效的氨肽酶抑制劑進行結(jié)構(gòu)修飾，以求找到對氨肽酶抑制作用更強，選擇性更高，毒副作用更弱的化合物已經(jīng)成為趨勢。結(jié)果顯示二氫吲哚-2，3-二酮衍生物，苯丙環(huán)庚酮類似物，亮氨酸脲基衍生物等均具有較強的ANP抑制劑作用和選擇性。但是這些化合物的生理學(xué)特性還沒有被闡明，進一步分析研究這些化合物對開發(fā)新型的抗腫瘤轉(zhuǎn)移，血管生成藥物具有重大意義。

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