esRAGE在慢性腎衰竭患者中的水平及與RAGE基因多態(tài)性的關(guān)系

摘要：目的 了解esRAGE在慢性腎衰竭患者血清中的水平及其與慢性腎衰竭患者腎功能的相關(guān)性，同時(shí)對(duì)其與RAGE基因多態(tài)性的關(guān)系進(jìn)行探討。方法 采集2010年10月～2011年5月于新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院腎病科住院的慢性腎衰竭患者血75份，其中代償期15例，失代償期21例，腎衰竭期15例，尿毒癥期24例，對(duì)照組血清27份。用Elisa方法檢測(cè)esRAGE水平，同時(shí)檢測(cè)肌酐，并提取患者DNA，擴(kuò)增RAGE基因，再用ALU I限制性?xún)?nèi)切酶的PCR-RFLP法，觀察RAGE基因多態(tài)性與esRAGE水平的相關(guān)性。結(jié)果 慢性腎衰竭患者血清中esRAGE水平明顯高于正常對(duì)照組，其水平與肌酐值呈正相關(guān)（r=0.450，P<0.05），RAGE的Gly82Ser位點(diǎn)的多態(tài)性以GG型為主，不同分期腎衰竭患者RAGE基因Gbly82Ser等位基因和基因型頻率無(wú)明顯差異。結(jié)論 慢性腎衰竭患者血清中esRAGE水平腎功損害程度有關(guān)，與RAGE基因Gly82Ser位點(diǎn)的多態(tài)性無(wú)關(guān)。

關(guān)鍵詞：終末糖基化產(chǎn)物受體；慢性腎衰竭；基因；多態(tài)性

終末糖基化產(chǎn)物受體（RAGE）可以與終末糖基化產(chǎn)物結(jié)合，將信息傳遞至細(xì)胞內(nèi)后導(dǎo)致下游的生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)生，目前已有的研究表明它參與了很多疾病的發(fā)病機(jī)制，如炎癥、血管疾病、糖尿病并發(fā)癥等。而esRAGE是近年發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性分泌性RAGE的剪接變體，它可以與終末糖基化產(chǎn)物結(jié)合，但由于缺乏胞內(nèi)段的部分，不能將病理信號(hào)傳遞到胞內(nèi)，因此被認(rèn)為可以阻止RAGE的許多病理效應(yīng)，它在冠心病、糖尿病、高血壓人群中的水平降低也支持這一觀點(diǎn)。但近年來(lái)一些研究發(fā)現(xiàn)，在慢性腎衰竭人群當(dāng)中，盡管可能并存的高血壓、糖尿病使esRAGE的水平有所降低，但較正常人仍明顯升高。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)此類(lèi)研究，其水平是否與腎功能減退的程度有關(guān)，尚不十分清楚，本研究進(jìn)一步的探討了esRAGE與慢性腎衰竭患者腎功之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 采集2010年10月～2011年5月于新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院腎病科住院的慢性腎衰竭患者血清75份，根據(jù)我國(guó)黃山會(huì)議分期法分期，其中代償期15例、失代償期21例、腎衰竭期15例、尿毒癥期24例（男性43例，女性32例），平均年齡（60±15）歲，對(duì)照組選用同期于我院行健康體檢患者，根據(jù)其檢查結(jié)果篩選出正常對(duì)照組27例（男性15例，女性12例），平均年齡（52±10）歲。

1.2研究方法

1.2.1主要試劑 esRAGEELISA試劑盒購(gòu)自B-BRIDGE公司，蛋白酶K，PCRmix，DNA提取試劑盒購(gòu)自天根公司，Alu I限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自Thermo公司等。

1.2.2 esRAGE檢測(cè) 清晨空腹抽取靜脈血3ml，加入含EDTA的抗凝管，所有標(biāo)本均復(fù)孔檢測(cè)。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定，按試劑盒（美國(guó)B-Bridge公司）提供步驟操作，測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm時(shí)的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算esRAGE濃度。

1.2.3 DNA抽提取靜脈血5～10ml，用天根DNA提取試劑盒依照說(shuō)明書(shū)提取DNA，產(chǎn)物用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280為1.6～1.8，-20℃冷凍準(zhǔn)備進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 PCR反應(yīng)及基因多態(tài)性檢測(cè) 引物序列為：上游引物5'GTA AGC GGG GCT CCT GTT GCA3'，下游引物5'GGC CAA GGC TGG GGT TGA AGG 3'， PCR反應(yīng)體系為：反應(yīng)總體積25ul，DAN模板4ul，上、下游引物各1ul，加雙蒸水至25μl，使用美國(guó)BIORADPCR擴(kuò)增儀。反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃3min，變性94℃30s，退火63℃45s，72℃45s共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min，4℃保存。取PCR產(chǎn)物8ul，加人1ulAlul限制性?xún)?nèi)切酶.10×Buffer 2μl，去離子水9μl，總反應(yīng)體積20μl，37℃溫育16 h。取酶切產(chǎn)物15μl，2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察結(jié)果，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察和記錄結(jié)果。GG純合子有248、149 bp兩個(gè)條帶，SS純合子有181、67、149bp三個(gè)條帶，GS雜合型有248、181、149、67bp四個(gè)條帶。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以表示，組間的比較采用多樣本的方差分析。esRAGE與臨床其他指標(biāo)分別進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。計(jì)算多態(tài)性基因型頻率，確認(rèn)符合Hardy-Wenberg平衡。計(jì)算等位基因頻率。

2 結(jié)果

2.1各組esRAGE結(jié)果及其與肌酐的關(guān)系見(jiàn)表1。

各組esRAGE比較水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩兩比較發(fā)現(xiàn)，除代償期與正常對(duì)照組之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），慢性腎衰竭其他各組較對(duì)照組均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）， 各組esRAGE與肌酐之間呈正相關(guān)（r=0.450，P=0.001，P<0.05）。

2.2各組RAGE基因Gly82ser多態(tài)性等位基因及基因型頻率比較（見(jiàn)表2） 各組均可見(jiàn)GG、GS基因型，但均未見(jiàn)SS基因型，RAGE基因Gly82Ser多態(tài)性等位基因和基因型頻率均未見(jiàn)明差異（如圖1，見(jiàn)表2）。

圖1 RAGE基因Gly82ser多態(tài)性

注：1、2、3均為GG基因型，4為GS基因型

上述結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，RAGE基因Gly82Ser等位基因和基因型頻率無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示esRAGE水平與RAGE基因Gly82Ser多態(tài)性無(wú)關(guān)。

3 討論

esRAGE是內(nèi)源性分泌性終末糖基化產(chǎn)物受體的剪接變體，近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)它在慢性心臟病、高血壓、糖尿病患者人群中水平顯著降低[1-3]，由于它缺乏RAGE的胞內(nèi)段，當(dāng)它和終末糖基化產(chǎn)物結(jié)合時(shí)，不會(huì)引起胞內(nèi)的下游的生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)生，因此，被推測(cè)對(duì)機(jī)體有保護(hù)性作用，部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)esRAGE在體內(nèi)的過(guò)表達(dá)，也證實(shí)了這一觀點(diǎn)[4]。但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[5]，在慢性腎衰竭這一心腦血管及糖尿病、高血壓高發(fā)人群中，esRAGE水平卻明顯升高，其原因目前尚不清楚。本研究通過(guò)選取不同階段的慢性腎衰竭患者，對(duì)其血清中esRAGE水平檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，與國(guó)外報(bào)道一致，慢性腎衰竭患者血清中esRAGE的水平的確明顯高于正常對(duì)照組，且這種升高在慢性腎衰竭失代償期才開(kāi)始逐漸顯現(xiàn)，伴隨著腎功能的惡化，esRAGE也逐漸升高，與肌酐呈明顯的正相關(guān)（r=0.450，P=0.001，P<0.05）。提示腎功能是esRAGE的一個(gè)強(qiáng)有力的影響因素，這可能由于①慢性腎衰竭時(shí)，患者體內(nèi)的終末糖基化產(chǎn)物由于腎功的減退不能排出體外，因此，刺激相關(guān)抗體增多所導(dǎo)致。②慢性腎衰竭患者體內(nèi)存在微炎癥狀態(tài)，這種微炎癥與腎功能的減退程度密切相關(guān)，而機(jī)體產(chǎn)生過(guò)多的esRAGE是對(duì)機(jī)體的一種自身保護(hù)，近年的研究發(fā)現(xiàn)老年慢性腎衰竭人群中低esRAGE水平與死亡率密切相關(guān)也支持這一觀點(diǎn)[6]。

esRAGE水平的增高是否與RAGE的基因多態(tài)性有關(guān)，目前還存在不同的觀點(diǎn)，其中研究最多的是Gly82Ser等位基因，但與其他報(bào)道一致，本組患者中也主要以GG基因型及GS基因型占優(yōu)勢(shì)，未見(jiàn)SS基因型，在各組人群中G與S出現(xiàn)的頻率無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示兩者無(wú)明顯相關(guān)。

近年的研究還表明，低水平的esRAGE與慢性腎衰竭心血管死亡率有關(guān)，但這還需要更多的人群去驗(yàn)證。如果這一觀點(diǎn)正確，那么，esRAGE將可能成為新的預(yù)測(cè)心腦血管死亡風(fēng)險(xiǎn)的Biomarker，同時(shí)還可能作為臨床治療此類(lèi)疾病的新的靶點(diǎn)。

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