有關(guān)兔視網(wǎng)膜色素上皮細胞體外培養(yǎng)技術(shù)及中藥含藥血清制備方法的探討

【摘要】細胞生物學是一切生命科學的重要基礎學科。近年來，細胞生物學發(fā)展迅速，其研究成果被廣泛地應用于生命科學的各個領域，成為現(xiàn)代生命科學的核心學科之一，本文就與細胞生物學密切相關(guān)的細胞培養(yǎng)技術(shù)（兔視網(wǎng)膜色素上皮細胞體外培養(yǎng)）及血清藥理學技術(shù)（中藥含藥血清制備）在關(guān)鍵步驟上做了較細致的探討。

【關(guān)鍵詞】兔視網(wǎng)膜色素上皮細胞；體外培養(yǎng)；中藥含藥血清；制備

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.11.685文章編號：1004-7484（2013）-11-6861-021體外培養(yǎng)兔視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞

組織培養(yǎng)工作始于1907年，美國動物學家Ross Granville Harrison為解決“神經(jīng)纖維的起源問題”，而設計出的“一種能在生活狀態(tài)下直接觀察正在生長的神經(jīng)末端的方法”，即哈里斯懸滴培養(yǎng)法，后經(jīng)美國醫(yī)生M.T.Burrows和Alexis Carrel不斷的改進和完善，組織培養(yǎng)技術(shù)得以迅速發(fā)展，作為一種研究組織和活細胞的良好方法，由于其具有的諸多優(yōu)越性，現(xiàn)已被廣泛應用于生物學、醫(yī)學與藥學的各個領域，成為重要的基礎科學之一。

視網(wǎng)膜色素上皮位于視網(wǎng)膜的最外層[1]，是由單層六角形的色素上皮細胞所構(gòu)成，它具有多種復雜的生化功能以及支持光感受器活動的色素屏障功能，并具有對視網(wǎng)膜外層傳遞來自脈絡膜的營養(yǎng)，和對光感受器外節(jié)脫落的膜盤及代謝產(chǎn)物進行吞噬的功能，其代謝異常和喪失，可引起視網(wǎng)膜感覺層發(fā)生繼發(fā)性變性改變，甚至導致失明。在組織胚胎學上視網(wǎng)膜色素上皮層由神經(jīng)外胚葉發(fā)育而來，胚胎4周時細胞內(nèi)出現(xiàn)色素顆粒，至第5周則完全充滿其中。體外培養(yǎng)的色素上皮細胞屬于貼附生長型細胞，其形態(tài)為扁平的多角形，細胞質(zhì)近中央處有圓形的細胞核，細胞之間緊密相靠、互相銜接，具有連接成片的能力。

1.1取材為了避免細胞的生長，在摘取兔眼時不能通過碘酒消毒，因為碘酒中的碘有抑制細胞生長的作用。另外還要注意將眼球摘除之后要將其放入冰箱當中，放置的時間要在15分鐘，并且在放置之前還要進行慶大霉素生理鹽水的浸泡，這樣在色素上皮分離、視網(wǎng)膜神經(jīng)分離就比較容易。為了減少碘進入兔眼視網(wǎng)膜的概率，此時應該著重關(guān)注眼球內(nèi)層的色素上皮細胞。這一點很關(guān)鍵。如果發(fā)現(xiàn)摘取的細胞生長緩慢，那么在排除了生物因素、物理因素之后就要考慮到這方面的原因。

1.2分離進行上述操作后，我們就要將其分離，此時將眼球球角鞏膜緣后的3毫米地方做一環(huán)形切口，將其去除晶體、角膜、玻璃體去除，力量一定要均勻，將眼科周圍的（彎）的頭部鈍緣通過視網(wǎng)膜向視乳頭進行輕刮，此時通過鑷子將視網(wǎng)膜上的神經(jīng)上皮去掉，這種方法是我們通過多次的實驗總結(jié)出來的，通過這個可以干凈、徹底地將視網(wǎng)膜進行分離。

1.3消化將去除視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層的眼球掛置于自制的眼杯中（由橡膠瓶塞和針灸針制成），滴加0.25%的胰蛋白酶沒至距角鞏膜緣切口1mm處，放入二氧化碳孵箱中消化10-15min，消化時間可根據(jù)具體情況而定，如新制胰蛋白酶消化時間可相應縮短。與先消化后分離相比，我們的方法可以較準確地把握消化時間，同時消化洗脫下來的色素上皮細胞也較多，雜細胞較少。

1.4吹打我們總結(jié)了一下，吹打30-40次后就可以充分的將細胞制成懸液；另外在進行沖洗時最好選用合成培養(yǎng)液如DMEM代替PBS緩沖液，目的是盡可能地模擬細胞生存的內(nèi)環(huán)境，減少細胞離體后再培養(yǎng)時的貼壁時間。

1.5關(guān)于微生物污染組織細胞在培養(yǎng)時一般失敗的最主要的原因就是微生物的污染，在體外培養(yǎng)的細胞沒有免疫能力，缺乏機體屏障，當發(fā)生細菌、霉菌時缺少相應的防御能力最終細胞出現(xiàn)死亡，鑒于這個原因，實驗的成功就必須做好防止污染的工作，進行操作時要做到無菌操作，并且確保各個環(huán)節(jié)都是無菌狀態(tài)。

我們的體會就是嚴格按要求操作，決不能馬虎、懶惰，更不能抱有僥幸心理。無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔而滅擦洗地面一次，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要75%酒精擦洗，然后紫外線消毒30min。實驗前認真清洗（經(jīng)清潔液處理過的器具先用自來水沖洗20遍，之后一次蒸餾水清洗5遍，最后再用3次蒸餾水清洗3遍）、消毒培養(yǎng)用品；實驗時也要保持無菌操作，如打開或封閉瓶口等都應在酒精燈近火焰處燒灼；拿取培養(yǎng)用品都應在超凈工作臺內(nèi)完成；現(xiàn)在進行細胞培養(yǎng)大多數(shù)是通過二氧化碳孵箱，因此需要再次強調(diào)一下孵箱中的消毒的問題，孵箱雖然為細胞的生長提供了良好的環(huán)境，例如提供了恒定的二氧化碳、在維持PH值穩(wěn)定時也做的相當?shù)牡轿?，但是開放式的培養(yǎng)，就給細菌、真菌提供了良好的生長環(huán)境，因此做好孵箱中細菌防止工作很重要，如果孵箱中的存在著污染那么整個細胞培養(yǎng)工作就會功虧一簣。因此定期地對箱內(nèi)清潔，定期地將水槽中的無菌的蒸餾水進行更換很重要。

由于在體外培養(yǎng)的細胞缺乏一定的抵抗能力，因此要做好微生物污染的工作，為了提高微生物的免疫力，可以選擇在培養(yǎng)液中加入一定的抗生素。但是通過實驗表明，加入抗生素的作用有限，并且也嘗試通過對細胞進行抗生素的沖擊療法、動物體內(nèi)接種、加溫處理等，上述方法都是有限的，因此做好預防工作是勢在必行。

附：兔視網(wǎng)膜色素上皮細胞體外分離、培養(yǎng)及鑒定6只家兔空氣栓塞法處死，隨即于無菌操作下摘除眼球，經(jīng)0.9%氯化鈉溶液充分沖洗后，在角鞏膜緣后3mm處環(huán)形剪開，棄眼前節(jié)和玻璃體，用顯微鑷輕輕撕去視網(wǎng)膜，加入0.25%胰蛋白酶，于37℃消化10-15min，后經(jīng)小牛血清終止消化，800r/min離心10min，棄上清，加入DMEM培養(yǎng)液，接種于50mL培養(yǎng)瓶中，在37℃，5%CO2，90%濕度的孵箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后，每3d換液一次，直到細胞融合，行1：2傳代，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)改變，經(jīng)細胞免疫化學抗角蛋白與抗S100染色進行視網(wǎng)膜色素上皮細胞鑒定，選擇1-2代對數(shù)生長期細胞，0.25%胰蛋白酶消化，制備成單細胞懸液。細胞計數(shù)板準確計數(shù)，調(diào)整細胞濃度到1×105個/ml待用。2中藥含藥血清（medicated serum）的制備

為在體外實驗中能觀察到中藥經(jīng)體內(nèi)胃腸吸收、生物轉(zhuǎn)化后的綜合整體藥理效應，日本昭和藥科大學田代真一教授于20世紀80年末首次提出“血清藥理學（serum pharmacology）”的概念[2]，具體是指將中藥或復方經(jīng)口給動物灌服，一定時間后采集動物血液，分離血清后用含有藥物成分的血清進行體外實驗的一種半體內(nèi)實驗方法。此法不僅可排除由于中藥復方粗制劑直接加入體外試驗系統(tǒng)對實驗造成的干擾，而且含藥血清能較真實地反映藥物在體內(nèi)的狀態(tài)，使體外試驗能較好地重復在體試驗的結(jié)果，它為科學地闡明中藥復方的作用及其機制提供了新的研究方法。

2.1供體動物的選擇為避免種屬差異導致的實驗偏差，我們選擇與培養(yǎng)細胞同種動物（家兔）作為血清供體，具體方法：在性別、年齡、體重方面與細胞供體家兔保持一致；為保證各實驗組細胞于造模前處于相同的實驗條件，我們給予各組同種正常血清（normal rabbit serum，NRS）孵化36h；鑒于生理、病理狀態(tài)下可能會產(chǎn)生較大的藥代動力學差異，給予含藥血清供體家兔造模。

2.2給藥方案的制定首先采用與臨床實際給藥途徑相同的方法（灌胃）給藥；其次為提高體外實驗體系中含藥血清的濃度，在給藥劑量上，我們結(jié)合臨床常用量、動物體表面積比值及實驗目的，設定成人臨床日用量的10倍和20倍（量效關(guān)系）作為最后的給藥劑量；最后在給藥時間及采血時間上，由于中藥及其復方成分復雜，血藥濃度及半衰期難以準確測定，我們采用供體動物實驗前禁食8-12h，每天灌胃給藥2次，連續(xù)給藥3d，末次給藥后1h，心臟取血的方法獲得含藥血清[3]。

2.3血清的滅活和保存由于血清中所含生物活性物質(zhì)可能會對體外培養(yǎng)的細胞產(chǎn)生毒性及嚴重干擾作用，我們對血清進行微孔濾膜（0.45μm、0.22μm）除菌，56℃水浴30min滅活，以去除非藥理性干擾；考慮到含藥血清長期低溫（-20℃，2個月）保存后藥效會顯著降低，我們將新鮮制備的含藥血清置于4℃冰箱保存，以備隨時取用，剩余血清-70℃以下低溫冰箱長期保存。參考文獻

[1]葛堅.眼科學（第2版）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：63-65.

[2]田代真一.“血清藥理學”と“血清藥化學”-漢方の藥理學から始まつた藥物血中濃度測定の新しぃ世界，TDM研究，1988（5）：54.

[3]李儀奎.中藥血清藥理學實驗方法的若干問題[J].中藥新藥與臨床藥理，1999，10（2）：95-98.