腫瘤壞死因子α對髓核細胞Ⅱ型膠原基因表達影響

【摘要】目的研究腫瘤壞死因子α（TNF-α）對大鼠髓核細胞Ⅱ型膠原基因表達的調(diào)節(jié)作用。方法通過酶消化法原代培養(yǎng)大鼠髓核細胞，然后將髓核細胞隨機分為4組：TNF-α刺激組，P38MAPK阻斷組，P-JNK/SAPK阻斷組和對照組。利用RT-PCR檢測髓核II型膠原的表達。結果TNF-α刺激組，P38MAPK阻斷組，P-JNK/SAPK阻斷組和對照組比較，Ⅱ型膠原基因表達明顯減少。結論TNF-α能夠抑制髓核細胞Ⅱ型膠原表達。

【關鍵詞】TNF-α；膠原；基因表達；髓核

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.11.084文章編號：1004-7484（2013）-11-6357-02

椎間盤主要是由髓核、纖維環(huán)和上下軟骨終板組成。椎間盤的退變是椎間盤退變性疾病的重要原因。TNF-α是導致椎間盤退變乃至椎間盤源性腰腿痛的重要物質(zhì)[1-2]，通過研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可誘導髓核細胞凋亡[3]，從而對膠原等細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生及調(diào)控方面意義重大，是與膠原代謝關系非常密切的細胞因子。本實驗研究TNF-α對髓核細胞Ⅱ型膠原表達的影響。1資料與方法

1.1動物出生24h SD大鼠，SPF級，青島市藥檢所。

1.2主要試劑TNF-α購自Sigma公司，TRNzol A+購自TIANGEN公司，瓊脂糖構造Ameresco公司，溴化乙錠（EB）購自Boehringer Mannheim公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒購自Promega公司；p38MAPK特異性阻斷劑（SB203580）及JNK特異性阻斷劑（SP600125）均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3細胞刺激模型及阻斷模型的建立將髓核細胞用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液（pH7.2），置于37℃、體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待生長到80%-90%融合時用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。將生長良好的髓核細胞制成細胞懸液，按1×104個/mL接種于6孔培養(yǎng)板中。隨機分成4組：TNF-α刺激組，P38MAPK阻斷組，P-JNK/SAPK阻斷組和對照組。每個培養(yǎng)孔為1組，TNF-α刺激組，每孔分別加入0.5mg/L TNF-α，重復3個孔，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h。P38MAPK阻斷組和P-JNK/SAPK阻斷組每孔先分別給予20μmol/L特異性P38MAPK阻斷劑（SB203580）和JNK/SAPK阻斷劑（SP600125），20min后再給予0.5mg/LTNF-α，重復3個孔。37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h后檢測相關指標。同時以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞為對照組。

1.4RT-PCR檢測TNF-α對大鼠Ⅱ型膠原mRNA的表達的影響采用TRizol一步法提取細胞總RNA。以逆轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA為模板，聚合酶鏈反應擴增目的基因。Ⅱ型膠原（185bp）引物序列為上游5’-CCGATCCCCTGCAGTACATG-3’和下游5’-GCTCTCGATCTGGTTGTTCAGC-3’，內(nèi)參β-actin（170bp）引物序列為上游5'-GTTGACATCCGTAAAGACC-3'和下游5'-CACCAATCCACACAGAGTA-3'。擴增條件：94℃預變性2min，94℃變性30s，60℃持續(xù)，30s，72℃延伸1min，循環(huán)35次，最后1個循環(huán)后72℃再延伸5min，4℃保存產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像儀自帶圖像分析軟件進行圖像分析，根據(jù)每種檢測基因的IVD比值（目的條帶OD值/內(nèi)參條帶OD值）進行半定量分析。

1.5統(tǒng)計學處理各組數(shù)據(jù)統(tǒng)計學采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行方差分析處理，并進行兩兩組間分析。將P<0.01定義為差異有顯著統(tǒng)計學意義，P<0.05定義為差異有統(tǒng)計學意義，P>0.05定義為差異無統(tǒng)計學意義。2結果

2.1各組細胞的形態(tài)學觀察當細胞完全融合后，實驗前各個細胞的邊界不清楚（圖1）。用TNF-α處理后，細胞伸出的偽足稍有收縮，使細胞的分界明顯，可見很多非正常細胞（圖2）。加入SB203580或SP600125后，仍可見細胞伸出的偽足稍有收縮，細胞的分界明顯，可見很多非正常細胞，較TNF-α組比較變化不大（圖3，4）。

2.2RT-PCR結果：TNF-α對II型膠原表達的影響根據(jù)測量的原始數(shù)據(jù)，各組結果分別為：對照組為0.76±0.02，TNF-α組為0.50±0.06，SB203580組為0.43±0.04，SP600125組為0.39±0.02，進行ANOVA分析，各組數(shù)據(jù)的方差齊，TNF-α組、SB203580組、SP600125組和對照組之間的均數(shù)的差別有顯著統(tǒng)計學意義。說明TNF-α組能夠抑制大鼠髓核細胞II型膠原的合成。而單獨應用SB203580或SP600125對TNF-α抑制大鼠髓核細胞II型膠原的合成無抑制作用（圖5，見表1）。

表1各組對大鼠髓核細胞II型膠原表達平均灰度值的影響（n=6）

分組1Type II collagen平均灰度值（χ±s）對照組10.76±0.02TNF-α組10.50±0.06*SB203580組10.43±0.04*SP600125組10.39±0.02*

3討論

通過上述的結論我們發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)發(fā)生退變的椎間盤在結構、功能上都和正常的椎間盤發(fā)生了很大的變化，在正常的椎間盤中沒有在髓核中發(fā)現(xiàn)I型膠原，但是隨著退變的椎間盤，II型膠原的含量越來越少，I型的膠原的含量越來越多，在正常的髓核中I型的膠原主要承受的是扭轉(zhuǎn)應力、牽拉力。但是II型的膠原一般承受的是適合變形的吸引壓的應力，并且II型的膠原表達方式主要是通過軟骨細胞，由此發(fā)現(xiàn)，椎間盤的生物力學、功能都是受細胞外基質(zhì)的影響。

髓核細胞的死亡和髓核細胞的多少有著密切的關系，由于椎間盤的蛻變，椎間盤的細胞的數(shù)量大量減少，在蛻變的椎間盤中髓核細胞會發(fā)生一定的反應，可以分泌出TNF-α等眾多炎癥因子，椎間盤之所以會出現(xiàn)凋亡，有著幾種誘發(fā)的因素，其中在其中很重要的因素就是炎癥因子。

本研究中RT-PCR結果顯示TNF-α組、SB203580組、SP600125組II型膠原表達較對照組比較均有明顯減少?？梢?，隨著髓核細胞的凋亡，II型膠原表達明顯減少。

由此我們推論，TNF-α可抑制髓核細胞Ⅱ型膠原合成，從而促進椎間盤的退變。參考文獻

[1]Segu in CA，PilliarRM，Roughley PJ，et al.Tumor necrosis factor-alpha modulates matrix production and catabolism in nucleus pulposus tissue[J].Spine，2005，30（17）：1940-1948.

[2]Abe Y，Akeda K，An H S，et al.Proinflammatory cytokines stimulate the expression of nerve growth factor by human intervertebral disc cells[J].Spine，2007，32（6）：635-642.

[3]董振輝，王德春.腫瘤壞死因子α誘導人髓核細胞凋亡的作用途徑[J].中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（50）：9321-9324.

[4]Rousseau MA，Ulrich JA，Bass EC，et al.Stab incision for inducing intervertebral disc degeneration in the rat.Spine，2007，32（1）：17-24.

[5]Le Maitre CL，F(xiàn)reemont AJ，Hoyland JA.Accelerated cellular senescence in degenerate intervertebral discs：a possible role in the pathogenesis of intervertebral disc degeneration.Arthritis Res Ther，2007，9（3）：R45.

[6]Saal JS.The role of inflammation in lumbar pain.Spine，1995，20（16）：1821-1827.

[7]Podichetty VK.The aging spine：the role of inflammatory mediators in intervertebral disc degeneration.Cell Mol Biol，2007，53（5）：4-18.

[8]Studer RK，Aboka AM，Gilbertson LG，et al.p38 MAPK Inhibition in Nucleus Pulposus Cells：A Potential Target for Treating Intervertebral Disc Degeneration.Spine，2007，32（25）：2827-2833.