內(nèi)毒素誘導大鼠心肌損傷時EPO及EPOR表達的實驗研究

[摘要] 目的 觀察內(nèi)毒素誘導大鼠心肌損傷時EPO 及EPO受體表達。 方法 20只雄性SD大鼠隨機分為LPS組和對照組，LPS組腹腔注射生理鹽水，連續(xù)處理 3 d后腹腔注射LPS 10 mg/kg，建立內(nèi)毒素心肌損傷模型。對照組與LPS組腹腔注射等量生理鹽水。腹腔注射6 h后于鼠尾部放血測定心肌損傷標志物，斷頸活殺取出心臟組織測定EPO 及EPO受體濃度。 結(jié)果 LPS組血清心肌損傷標志物（cTnⅠ、CK、CK-MB）水平均顯著高于對照組（t = 6.751、5.346、3.432，P < 0.05）。LPS組心臟組織EPO及EPO受體水平均顯著高于對照組（t = 2.587、4.306，P < 0.05）。 結(jié)論 內(nèi)毒素誘導大鼠心肌損傷時存在EPO及EPO受體高表達，為外原性EPO在膿毒癥的心臟保護中的應(yīng)用提供了可行性。

[關(guān)鍵詞] 內(nèi)毒素；心肌損傷；促紅細胞生成素；促紅細胞生成素受體；動物實驗

[中圖分類號] R363.1+4 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）18-0008-03

膿毒癥是臨床常見危重病之一，膿毒癥已成為世界上ICU患者死亡的主要原因，膿毒癥休克患者死亡率高達46.5%[1]。嚴重膿毒癥時心肌抑制的發(fā)生率高達 80%，發(fā)生心肌損傷達 40%，嚴重影響患者的預后[2]。細菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素釋放入血是膿毒癥發(fā)生的關(guān)鍵，內(nèi)毒素可誘導機體出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征從而造成多臟器損傷，特別是引起心肌抑制和心肌損傷，而目前對于膿毒癥心肌抑制和心肌損傷尚無有效的治療方法。促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是一種糖蛋白造血細胞生長因子，主要由人體中的腎小管周圍毛細血管床的間質(zhì)細胞產(chǎn)生，EPO與促紅細胞生成素受體（EPOR）結(jié)合調(diào)控紅系干細胞增殖、分化、成熟，促進網(wǎng)織紅細胞釋放入血的生物學作用。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)[3]，在發(fā)生貧血、缺氧、急性損傷等情況下則能夠?qū)?EPO 及其受體的產(chǎn)生起到負反饋調(diào)節(jié)作用。因此，本課題組于2009年11月～2010年1月通過內(nèi)毒素誘導大鼠心肌損傷，并采用ELISA法測定心臟組織中EPO及EPOR濃度，以探討其可能的保護機制。

1材料與方法

1.1藥品與試劑

脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS， L2880）、3-去氮腺苷（3-deazaadenosine）、EPO（CSB-E04539 m）及EPO受體（CSB-E0732l m）均為 Sigma公司產(chǎn)品，ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純，水為去離子水。

1.2 實驗動物

健康雄性SD大鼠20只，（體重300～320 g，SPF級，華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供），按清潔級大鼠的要求標準飼養(yǎng)。20只大鼠隨機分為脂多糖（LPS）組和對照組各10只。LPS組腹腔注射生理鹽水，連續(xù)處理 3 d后腹腔注射LPS 10 mg/kg，建立內(nèi)毒素心肌損傷模型[4]。對照組與LPS組腹腔注射等量生理鹽水。

1.3觀察指標

①心肌損傷標志物測定：腹腔注射6 h后于鼠尾部放血約0.5 mL/只，低溫3000轉(zhuǎn)/min離心15 min分取血清，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆么郎y心肌損傷標志物，包括：心肌肌鈣蛋白I（cTnⅠ）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量，采用ELISA檢測心肌損傷標志物的濃度，檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行。②EPO及EPOR濃度的測定：腹腔注射6 h后鼠尾部放血后立即斷頸活殺取出心臟組織于-20℃保存，然后取心肌組織標本在冰凍條件下研磨，制備心肌組織勻漿液，采用ELISA檢測EPO及EPOR濃度，檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行，反應(yīng)終止后用酶標儀在450 nm測定A值，先測得樣本的A值，根據(jù)標準品的濃度及A值計算出EPO及EPOR的相對濃度。

1.4 統(tǒng)計學處理

計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，應(yīng)用SPSS 13.0數(shù)據(jù)分析軟件進行數(shù)據(jù)分析，各組間EPO及EPOR和心肌損傷標志物（cTnⅠ、CK、CK-MB）比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS組和對照組大鼠心肌損傷標志物水平檢測結(jié)果比較

大鼠在腹腔注藥6 h后測定血清心肌損傷標志物水平，結(jié)果顯示，LPS組大鼠血清心肌損傷標志物（cTnⅠ、CK、CK-MB）水平均顯著高于對照組（t =6.751、5.346、3.432，P < 0.01）。見表1。

3討論

目前，我國膿毒癥患者的死亡率居高不下，約為20%～40%，其中50%的膿毒癥患者出現(xiàn)心肌受損[5]，防治內(nèi)毒素性心肌損傷對降低膿毒癥患者的死亡率具有十分重要的意義。LPS是由O-抗原、核心多糖和類脂A三部分構(gòu)成的革蘭陰性細菌外表層的一種生物大分子，其中只有LPS分子的類脂A基團具有內(nèi)毒素活性，細菌類脂A基團一旦侵入人體內(nèi)可以誘發(fā)多種疾病[6]。感染性休克、敗血癥、多器官功能性衰竭等臨床常見的革蘭陰性菌所致的疾病均與類脂A密切相關(guān)[7]。國外的研究報道[8]，內(nèi)毒素可以激發(fā)多細胞因子參與機體反應(yīng)，并誘導心肌細胞凋亡，這可能是導致心肌損傷的重要機制之一。cTnⅠ、CK、CK-MB是反應(yīng)心肌細胞損傷較為敏感的指標。當心肌細胞因缺血、缺氧等因素發(fā)生變性壞死，cTnI外漏并通過受損的細胞膜彌散進入細胞間質(zhì)，隨之進入血管引起血清cTnI的升高[9]。CK-MB是一種細胞內(nèi)酶，當心肌缺血或者再灌注損傷時，細胞膜通透性升高導致細胞內(nèi)的CK、CK-MB大量入血[10]。CK和CK-MB特異性地反映心肌細胞受損程度，血清中CK和CK-MB越高，則表明心肌受損越嚴重。本研究在腹注LPS后，LPS組大鼠血清cTnⅠ、CK 、CK-MB水平顯著高于對照組，提示LPS能引起心臟組織功能的病理學改變，同時也提示本研究建立內(nèi)毒素心肌損傷模型是成功的。

人類EPO基因由 166 個氨基酸殘基組成，定位于 7 號染色體長臂 22 區(qū)（7q22），體內(nèi)EPO主要由低氧誘導產(chǎn)生，腎臟分泌入循環(huán)。EPO的作用是維持紅細胞造血前體細胞的存活并促進其分裂，誘導晚期紅系祖細胞生長成為成熟的紅細胞[11]。EPO促進紅細胞生成的生物學效應(yīng)主要是通過位于骨髓紅系祖細胞表面的特異性 EPO 受體來完成的，EPO及EPOR結(jié)合發(fā)揮生物活性，激活多種信號轉(zhuǎn)導途徑發(fā)揮抗凋亡作用[12]。據(jù)研究報道[13]，EPO及EPOR的高表達可能與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展、新生血管生成有著密切的關(guān)系；此外，EPO及EPOR信號途徑在生理及病理的促進心、腦損傷修復等多方面起重要作用[14]。近年來，EPO 參與胚胎的正常發(fā)育、促進血管生成、組織保護作用、抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化作用等多種非造血生物作用成為研究的熱點。但目前尚無證據(jù)證明EPO及EPOR在心肌損傷是否也存在其表達水平上調(diào)尚不清楚，有內(nèi)毒素性心肌損傷的發(fā)病機制還存有爭議，因此，本研究通過動物實驗的方式來研究內(nèi)毒素誘導的心肌損傷時EPO及EPOR的表達水平有著非常重要的現(xiàn)實意義。

研究結(jié)果顯示，在腹注LPS后，LPS組大鼠心肌細胞EPO及EPOR濃度明顯高于對照組，表明內(nèi)毒素誘導大鼠心肌損傷時存在EPO及EPOR高表達，提示體內(nèi)感染可能是 EPO 及其受體生成的主要刺激因素，分析其原因可能是急性感染導致心肌細胞受損，EPO及EPOR濃度速度上升，使EPO及EPOR調(diào)控系統(tǒng)失活，從而使EPO對心臟的保護作用減弱，這為外源性EPO在膿毒癥的心臟保護中的應(yīng)用提供了可行性。

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（收稿日期：2013-04-11）