[摘要] 目的 觀察內(nèi)毒素誘導大鼠心肌損傷時EPO 及EPO受體表達。 方法 20只雄性SD大鼠隨機分為LPS組和對照組,LPS組腹腔注射生理鹽水,連續(xù)處理 3 d后腹腔注射LPS 10 mg/kg,建立內(nèi)毒素心肌損傷模型。對照組與LPS組腹腔注射等量生理鹽水。腹腔注射6 h后于鼠尾部放血測定心肌損傷標志物,斷頸活殺取出心臟組織測定EPO 及EPO受體濃度。 結(jié)果 LPS組血清心肌損傷標志物(cTnⅠ、CK、CK-MB)水平均顯著高于對照組(t = 6.751、5.346、3.432,P < 0.05)。LPS組心臟組織EPO及EPO受體水平均顯著高于對照組(t = 2.587、4.306,P < 0.05)。 結(jié)論 內(nèi)毒素誘導大鼠心肌損傷時存在EPO及EPO受體高表達,為外原性EPO在膿毒癥的心臟保護中的應(yīng)用提供了可行性。
[關(guān)鍵詞] 內(nèi)毒素;心肌損傷;促紅細胞生成素;促紅細胞生成素受體;動物實驗
[中圖分類號] R363.1+4 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701(2013)18-0008-03
膿毒癥是臨床常見危重病之一,膿毒癥已成為世界上ICU患者死亡的主要原因,膿毒癥休克患者死亡率高達46.5%[1]。嚴重膿毒癥時心肌抑制的發(fā)生率高達 80%,發(fā)生心肌損傷達 40%,嚴重影響患者的預后[2]。細菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素釋放入血是膿毒癥發(fā)生的關(guān)鍵,內(nèi)毒素可誘導機體出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征從而造成多臟器損傷,特別是引起心肌抑制和心肌損傷,而目前對于膿毒癥心肌抑制和心肌損傷尚無有效的治療方法。促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)是一種糖蛋白造血細胞生長因子,主要由人體中的腎小管周圍毛細血管床的間質(zhì)細胞產(chǎn)生,EPO與促紅細胞生成素受體(EPOR)結(jié)合調(diào)控紅系干細胞增殖、分化、成熟,促進網(wǎng)織紅細胞釋放入血的生物學作用。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)[3],在發(fā)生貧血、缺氧、急性損傷等情況下則能夠?qū)?EPO 及其受體的產(chǎn)生起到負反饋調(diào)節(jié)作用。因此,本課題組于2009年11月~2010年1月通過內(nèi)毒素誘導大鼠心肌損傷,并采用ELISA法測定心臟組織中EPO及EPOR濃度,以探討其可能的保護機制。
1材料與方法
1.1藥品與試劑
脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS, L2880)、3-去氮腺苷(3-deazaadenosine)、EPO(CSB-E04539 m)及EPO受體(CSB-E0732l m)均為 Sigma公司產(chǎn)品,ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純,水為去離子水。
1.2 實驗動物
健康雄性SD大鼠20只,(體重300~320 g,SPF級,華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供),按清潔級大鼠的要求標準飼養(yǎng)。20只大鼠隨機分為脂多糖(LPS)組和對照組各10只。LPS組腹腔注射生理鹽水,連續(xù)處理 3 d后腹腔注射LPS 10 mg/kg,建立內(nèi)毒素心肌損傷模型[4]。對照組與LPS組腹腔注射等量生理鹽水。
1.3觀察指標
①心肌損傷標志物測定:腹腔注射6 h后于鼠尾部放血約0.5 mL/只,低溫3000轉(zhuǎn)/min離心15 min分取血清,置-20℃冰箱保存?zhèn)溆么郎y心肌損傷標志物,包括:心肌肌鈣蛋白I(cTnⅠ)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量,采用ELISA檢測心肌損傷標志物的濃度,檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行。②EPO及EPOR濃度的測定:腹腔注射6 h后鼠尾部放血后立即斷頸活殺取出心臟組織于-20℃保存,然后取心肌組織標本在冰凍條件下研磨,制備心肌組織勻漿液,采用ELISA檢測EPO及EPOR濃度,檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行,反應(yīng)終止后用酶標儀在450 nm測定A值,先測得樣本的A值,根據(jù)標準品的濃度及A值計算出EPO及EPOR的相對濃度。
1.4 統(tǒng)計學處理
計量資料用均數(shù)±標準差(x±s)表示,應(yīng)用SPSS 13.0數(shù)據(jù)分析軟件進行數(shù)據(jù)分析,各組間EPO及EPOR和心肌損傷標志物(cTnⅠ、CK、CK-MB)比較采用t檢驗,以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2 結(jié)果
2.1 LPS組和對照組大鼠心肌損傷標志物水平檢測結(jié)果比較
大鼠在腹腔注藥6 h后測定血清心肌損傷標志物水平,結(jié)果顯示,LPS組大鼠血清心肌損傷標志物(cTnⅠ、CK、CK-MB)水平均顯著高于對照組(t =6.751、5.346、3.432,P < 0.01)。見表1。
3討論
目前,我國膿毒癥患者的死亡率居高不下,約為20%~40%,其中50%的膿毒癥患者出現(xiàn)心肌受損[5],防治內(nèi)毒素性心肌損傷對降低膿毒癥患者的死亡率具有十分重要的意義。LPS是由O-抗原、核心多糖和類脂A三部分構(gòu)成的革蘭陰性細菌外表層的一種生物大分子,其中只有LPS分子的類脂A基團具有內(nèi)毒素活性,細菌類脂A基團一旦侵入人體內(nèi)可以誘發(fā)多種疾病[6]。感染性休克、敗血癥、多器官功能性衰竭等臨床常見的革蘭陰性菌所致的疾病均與類脂A密切相關(guān)[7]。國外的研究報道[8],內(nèi)毒素可以激發(fā)多細胞因子參與機體反應(yīng),并誘導心肌細胞凋亡,這可能是導致心肌損傷的重要機制之一。cTnⅠ、CK、CK-MB是反應(yīng)心肌細胞損傷較為敏感的指標。當心肌細胞因缺血、缺氧等因素發(fā)生變性壞死,cTnI外漏并通過受損的細胞膜彌散進入細胞間質(zhì),隨之進入血管引起血清cTnI的升高[9]。CK-MB是一種細胞內(nèi)酶,當心肌缺血或者再灌注損傷時,細胞膜通透性升高導致細胞內(nèi)的CK、CK-MB大量入血[10]。CK和CK-MB特異性地反映心肌細胞受損程度,血清中CK和CK-MB越高,則表明心肌受損越嚴重。本研究在腹注LPS后,LPS組大鼠血清cTnⅠ、CK 、CK-MB水平顯著高于對照組,提示LPS能引起心臟組織功能的病理學改變,同時也提示本研究建立內(nèi)毒素心肌損傷模型是成功的。
人類EPO基因由 166 個氨基酸殘基組成,定位于 7 號染色體長臂 22 區(qū)(7q22),體內(nèi)EPO主要由低氧誘導產(chǎn)生,腎臟分泌入循環(huán)。EPO的作用是維持紅細胞造血前體細胞的存活并促進其分裂,誘導晚期紅系祖細胞生長成為成熟的紅細胞[11]。EPO促進紅細胞生成的生物學效應(yīng)主要是通過位于骨髓紅系祖細胞表面的特異性 EPO 受體來完成的,EPO及EPOR結(jié)合發(fā)揮生物活性,激活多種信號轉(zhuǎn)導途徑發(fā)揮抗凋亡作用[12]。據(jù)研究報道[13],EPO及EPOR的高表達可能與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展、新生血管生成有著密切的關(guān)系;此外,EPO及EPOR信號途徑在生理及病理的促進心、腦損傷修復等多方面起重要作用[14]。近年來,EPO 參與胚胎的正常發(fā)育、促進血管生成、組織保護作用、抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化作用等多種非造血生物作用成為研究的熱點。但目前尚無證據(jù)證明EPO及EPOR在心肌損傷是否也存在其表達水平上調(diào)尚不清楚,有內(nèi)毒素性心肌損傷的發(fā)病機制還存有爭議,因此,本研究通過動物實驗的方式來研究內(nèi)毒素誘導的心肌損傷時EPO及EPOR的表達水平有著非常重要的現(xiàn)實意義。
研究結(jié)果顯示,在腹注LPS后,LPS組大鼠心肌細胞EPO及EPOR濃度明顯高于對照組,表明內(nèi)毒素誘導大鼠心肌損傷時存在EPO及EPOR高表達,提示體內(nèi)感染可能是 EPO 及其受體生成的主要刺激因素,分析其原因可能是急性感染導致心肌細胞受損,EPO及EPOR濃度速度上升,使EPO及EPOR調(diào)控系統(tǒng)失活,從而使EPO對心臟的保護作用減弱,這為外源性EPO在膿毒癥的心臟保護中的應(yīng)用提供了可行性。
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(收稿日期:2013-04-11)