人胎盤間充質干細胞大鼠體內移植的初步免疫學研究

[摘要] 目的 了解大鼠對于人胎盤間充質干細胞是否存在天然免疫耐受，分析人胎盤間充質干細胞在大鼠體內出現(xiàn)免疫排斥的可能。 方法 分離提取并鑒定人胎盤間充質干細胞，觀察大鼠尾靜脈移植人胎盤間充質干細胞后有無出現(xiàn)相關的免疫排斥癥狀、細胞在大鼠體內的分布情況及臟器的病理改變。 結果 大鼠尾靜脈移植人胎盤間充質干細胞后未出現(xiàn)急慢性免疫排斥反應，肝、腎、肺可見標記后的人胎盤間充質干細胞的分布，但相關病理切片未見明顯的淋巴細胞浸潤和纖維組織增生現(xiàn)象。 結論 人胎盤間充質干細胞與大鼠臟器間存在天然的免疫耐受。

[關鍵詞] 胎盤； 間充質干細胞；免疫排斥

[中圖分類號] R742.34 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）18-0005-03

近年來，由于間充質干細胞的研究（Mesenchymal stem cells，MSCs）逐步深入，人們對間充質干細胞移植治療大面積骨缺損[1-2]、神經系統(tǒng)損傷[3]、卵巢早衰[4]等疾病產生了濃厚的興趣，而在種類眾多的間充質干細胞中，人胎盤來源的間充質干細胞被認為是免疫原性最低的干細胞之一[5-6]，也是目前研究的熱點之一，學者們多通過大鼠移植人胎盤間充質干細胞來進行相關疾病的研究[7-10]。然而，對于人胎盤間充質干細胞是否在人鼠間中存在天然的免疫耐受，尚無相關的動物實驗基礎。因此，為了了解人胎盤間充質干細胞移植對大鼠各臟器功能的影響，客觀的分析人胎盤間充質干細胞在大鼠體內出現(xiàn)免疫排斥的可能，避免由于免疫的因素掩蓋或降低甚至誤導了研究因素的作用，我們對正常大鼠卵巢尾靜脈注射移植人胎盤間充質干細胞做了一個初步的研究。

1 材料與方法

1.1主要試劑

DMEM-F12培養(yǎng)基（hyclone）、胰酶（hyclone）、胎牛血清（hyclone）、CO2培養(yǎng)箱（日本三洋）、流式細胞儀（FACSCALIBUR），PKH26試劑盒（sigma）（089K0781）。

1.2 方法

取足月剖宮產分娩的健康胎兒的胎盤，在無菌條件下剪取小塊蛻膜側胎盤組織，進行人胎盤間充質干細胞的原代培養(yǎng)。取第2代的胎盤間充質干細胞，胰酶消化后制成單細胞懸液，采用流式細胞儀進行胎盤間充質干細胞免疫表型分析。PKH26標記胎盤間充質干細胞，按sigma公司的說明書進行操作。實驗分兩組，每組10只大鼠，為wista近交系大鼠，體重180～200 g。第一組為對照組，不做任何處理；第二組為尾靜脈注射組。移植成功后觀察在大鼠體內的分布狀況和大鼠一般情況的觀察，評估PKH26標記的胎盤間充質干細胞在大鼠體內移植的安全性和可行性。

2 結果

2.1胎盤間充質干細胞的形態(tài)觀察及生長情況

分離出的胎盤間充質干細胞貼壁生長，細胞呈長梭形，類似于成纖維細胞樣，見胞漿突起，胞漿豐富，核大，呈平行排列或旋渦狀生長，細胞增殖活躍，約3～4 d 即可鋪滿全層，可穩(wěn)定傳代。見圖1。

2.2 胎盤間充質干細胞免疫表型分析

取第2代細胞進行流式細胞儀檢測，結果發(fā)現(xiàn)胎盤間充質干細胞表達 CD29，CD44，CD73，CD90、CD105；不表達CD14，CD34（造血干細胞抗原），CD45（白細胞共同抗原）、CD106、CD133和HLA-DR（MHC-II），提示所得貼壁細胞為人間充質干細胞， 表達間充質細胞特異性抗原標志而不表達造血干細胞、內皮細胞特異性抗原。見圖2。

2.3 胎盤間充質干細胞標記結果

細胞標記后染料在細胞膜上分布均勻一致，在倒置熒光顯微鏡下呈紅色熒光，細胞輪廓清晰。標記百分率為100%。臺盼藍染色細胞的存活率為99%。見圖3。

2.4 大鼠移植胎盤間充質干細胞情況

移植組大鼠進食、活動、大小便均與對照組無異，未發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)嗜睡、嘔吐、抽搐、猝死、無尿、精神狀態(tài)異常及偏癱等有關器官栓塞的癥狀，亦未發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)呼吸困難、出血、脫毛、血尿、血便等急慢性免疫排斥反應。

2.5大鼠體內的胎盤間充質干細胞的分布

熒光顯微鏡下可見PKH26標記后呈紅色熒光的胎盤間充質干細胞，均勻分布在肺臟、肝臟及腎臟皮質。肝臟組織可見均勻分布紅色熒光，整個肝臟結構組織清晰可見，包括肝臟的膽管和肝臟大血管均可見；在腎臟中亦可見紅色熒光細胞主要分布在腎臟皮質，部分腎小體輪廓清晰可見。見圖4。

2.6 大鼠相關臟器的病理切片

移植組大鼠肝、腎、大腦、膀胱HE染色后未見明顯淋巴細胞浸潤和組織結構的破壞，與正常組大鼠未見明顯區(qū)別。見圖5。

3 討論

間充質干細胞具有多向分化潛能，在體外特定的誘導條件下能向成骨細胞、成軟骨細胞、成脂肪細胞、骨髓基質甚至肝臟細胞和神經細胞等分化，是目前細胞治療、基因治療中理想的種子細胞，在神經系統(tǒng)損傷、卵巢早衰、糖尿病、骨缺損等疾病的治療中具有極大的應用前景。而在眾多種類的間充質干細胞中，尤其以胎盤來源的間充質干細胞優(yōu)點突出，如來源豐富，易采集，病原微生物感染率和免疫原性較低，無致瘤性和倫理限制等成為目前研究的熱點。然而，國內外學者對于間充質干細胞治療相關疾病的機制研究，多采用動物模型進行實驗，雖尚未見急慢性免疫排斥的報道，但并不代表著大鼠對于人胎盤來源的間充質干細胞存在天然的免疫耐受，因為實驗中的大鼠多為相關疾病的模型，非正常狀態(tài)下大鼠。鐘志年等[11]選擇胎盤間充質干細胞，測定其細胞周期及凋亡率情況，原子力顯微鏡觀察細胞的表面結構，及向成骨細胞誘導分化，探討胎盤間充質干細胞生物學特性和超微結構，并評價其在骨組織工程學中修復重建的應用前景，結果表明人胎盤間充質干細胞為成纖維細胞樣，增殖能力強，9.7%的細胞處于G2/M期或者S期，微結構分析顯示其細胞代謝活躍，黏附能力強，能被誘導分化為成骨細胞，結論認為人胎盤間充質干細胞具備適合應用于骨組織工程學的良好生物學特性，并避免了免疫排斥和倫理問題，可望成為骨組織修復重建中的一個新的治療途徑。本次研究我們選擇了正常的成年大鼠，移植前后均未用任何藥物進行免疫干預。

事實上，人間充質干細胞用于實驗動物研究的結果不令人滿意，所以近年來有學者使用大鼠胎盤來源的間充質干細胞用于動物實驗研究。劉志鵬等[12]通過膠原酶消化法從大鼠胎盤分離并得到間充質干細胞，并建立從大鼠胎盤分離間充質干細胞的方法，觀察其基本生物學特性，結果表明，原代細胞培養(yǎng)8 h后細胞貼壁，24 h內細胞形成集落，第4代細胞大小、形態(tài)基本一致，以梭形為主，細胞周期檢測提示G0/G1期、S期、G2期的比例分別為83.76%，8.01%，8.23%，免疫表型分析其表達CD29和CD90，不表達CD45，結論認為胎盤間充質干細胞具有成脂和成骨分化的潛能。本研究結果也顯示大鼠尾靜脈移植人胎盤間充質干細胞后1個月，大鼠肺、肝、腎等組織均可見標記了PKH26的人胎盤間充質干細胞的分布，說明移植的人胎盤間充質干細胞在大鼠體內可成功存活。病理切片也顯示腦、肝、腎、膀胱等臟器未見明顯的淋巴細胞浸潤和纖維組織增生現(xiàn)象，說明人胎盤間充質干細胞的移植未對大鼠相關臟器產生免疫排斥影響。整個觀察期間大鼠均無明顯的急慢性的免疫排斥反應，如呼吸困難、出血、脫毛、血尿、血便等，以上結果均證明大鼠對人胎盤來源的間充質干細胞存在天然的免疫耐受。這種免疫耐受有可能源于胎盤間充質干細胞的低免疫原性甚至是無免疫原性。原因可能與以下因素有關：①胎盤在母兒體內起著重要的免疫屏障和激素分泌的作用[13]，所以胎盤來源的間充質干細胞從理論上講免疫原性更低，甚至不排除無免疫原性的可能，并且其分泌的免疫調節(jié)活性因子，對免疫功能排斥具有調節(jié)作用。②人胎盤間充質干細胞的HLA-DR表面標記陰性。HLA又稱移植抗原，能啟動免疫應答，參與T細胞的分化，誘導免疫應答，胎盤間充質干細胞的HLA-DR表面標記陰性提示了其低免疫原性的部分原因。因此，人胎盤間充質干細胞在研究相關疾病的動物模型中，即便是人-鼠間的異種間移植，但由于存在天然的免疫耐受，對實驗研究的結果影響甚小。

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（收稿日期：2013-04-09）