妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥孕婦胎盤(pán)床中HIF—1α的表達(dá)及臨床意義

[摘要] 目的 探討缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α在妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（ICP）患者胎盤(pán)床中的表達(dá)及臨床意義。 方法 采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)HIF-1α在22例正常妊娠胎盤(pán)床組織和21例ICP胎盤(pán)床組織中的表達(dá)。 結(jié)果 22例正常妊娠胎盤(pán)床組織HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)9例，總陽(yáng)性率為40.91%，21例ICP胎盤(pán)床組織中HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)15例，總陽(yáng)性率為71.43%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。結(jié)論 HIF-1α在ICP患者胎盤(pán)床組織中的高表達(dá)，從蛋白水平證實(shí)HIF-1α可能是ICP患者缺氧的一個(gè)敏感指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α；妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥；免疫組織化學(xué)；胎盤(pán)床

[中圖分類(lèi)號(hào)] R714.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）16-0044-02

缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factors，HIF）廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人類(lèi)的多種組織細(xì)胞中，是細(xì)胞在缺氧環(huán)境中產(chǎn)生的具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，受缺氧信號(hào)調(diào)控，是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧代謝的關(guān)鍵因子，與胎盤(pán)胎兒發(fā)育密切相關(guān)，是一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，在正常和病理妊娠中起重要作用[1，2]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，HIF異常與妊娠相關(guān)缺氧性疾病，如胎兒生長(zhǎng)受限、子癇前期等有關(guān)[3，4]。妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）是發(fā)生于妊娠中晚期的一種嚴(yán)重的并發(fā)癥，其發(fā)病率有明顯的地域和種族差異，以瘙癢和黃疸為主要癥狀，該病使早產(chǎn)、胎兒窘迫發(fā)病率升高，且胎兒死亡常常突然發(fā)生，具有難以監(jiān)測(cè)和預(yù)料的特征，是導(dǎo)致圍產(chǎn)兒病死率升高的主要原因之一。ICP與胎兒急慢性缺氧密切相關(guān)，本文采用免疫組化SP法研究ICP患者胎盤(pán)床組織細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)，從蛋白水平探討ICP發(fā)生缺氧的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象

選擇2010年6月～2011年6月在杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科因ICP、胎位不正、社會(huì)因素等擇期行剖宮產(chǎn)分娩的單胎產(chǎn)婦43例， 分為對(duì)照組22例、ICP組21 例，所有病例均排除內(nèi)科合并癥及妊娠并發(fā)癥。ICP組診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《婦產(chǎn)科學(xué)》[5]，對(duì)照組及ICP組孕婦平均年齡、孕產(chǎn)次、孕周、新生兒出生體重、新生兒Apgar評(píng)分均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。

1.2 標(biāo)本的采集與處理

胎盤(pán)床組織結(jié)構(gòu)包括底蛻膜及其鄰近的子宮淺肌層， 參照Dixon等[6] 的方法獲取胎盤(pán)床標(biāo)本，標(biāo)本的收集均獲得患者本人的知情同意。即在剖宮產(chǎn)胎兒娩出后，確定胎盤(pán)附著子宮壁位置， 剝離胎盤(pán)，暴露胎盤(pán)床，于胎盤(pán)臍帶附著位置子宮壁楔形取材，大小約1.0 cm×1.0 cm ×0.5 cm，包括底蛻膜及其下的子宮淺肌層。壓迫或縫合活檢造成的破損區(qū)止血，隨著子宮的收縮， 創(chuàng)面迅速止血閉合。所取標(biāo)本用生理鹽水漂洗干凈，10%福爾馬林液固定，酒精脫水，石蠟包埋、切片，光鏡觀察肌層有滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)者為胎盤(pán)床，免疫組化染色。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

采用SP法進(jìn)行免疫組化染色。常規(guī)石蠟切片，熱修復(fù)抗原，滴加兔抗多克隆抗體一抗HIF-1α（ab51608）（購(gòu)自Abcam公司）1：150稀釋?zhuān)覝兀s20℃）孵育1 h，滴加二抗（購(gòu)自丹麥DAKO公司），室溫孵育1 h，DAB（試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)脂封片，閱片，圖像分析。

1.4 圖像分析

由專(zhuān)業(yè)的病理科醫(yī)生對(duì)切片進(jìn)行閱片，200倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)不同視野，觀察所選擇的高倍鏡視野中所有的細(xì)胞，以細(xì)胞漿和（或）細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和細(xì)胞陽(yáng)性百分率得分之和進(jìn)行判定：①著色強(qiáng)度：無(wú)著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色2分，棕褐色為3分；②細(xì)胞陽(yáng)性率：<5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分；以上兩結(jié)果相加為免疫組化積分：0分為陰性（-），1～2分為（+），3～4分為（++），5～6分為（+++）， （+）～（+++）定為陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，采用χ2檢驗(yàn)，P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

HIF-1α在對(duì)照組及ICP組胎盤(pán)床組織的底蛻膜及其下的子宮淺肌層中滋養(yǎng)細(xì)胞的胞漿和胞核均有表達(dá)，以胞核表達(dá)為主，對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)率40.91%，ICP組HIF-1α 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率71.43%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05），見(jiàn)表1及圖1。

3 討論

缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）與胎盤(pán)胎兒發(fā)育密切相關(guān)，是哺乳動(dòng)物及人類(lèi)體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，受缺氧信號(hào)調(diào)控，參與缺氧誘導(dǎo)多種基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，在細(xì)胞對(duì)缺氧反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。其中主要發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的是HIF-1α，它對(duì)缺氧更具有敏感性，是一種在缺氧情況下能誘導(dǎo)和DNA特異結(jié)合的核蛋白，僅存在于缺氧細(xì)胞的細(xì)胞核中，是至今發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子，低氧時(shí)在組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)；正常條件下，組織中HIF-1α的表達(dá)很少，缺氧時(shí)表達(dá)明顯增高[7]， HIF-1α蛋白主要分布在缺氧的胎盤(pán)合體滋養(yǎng)細(xì)胞及細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的胞核或胞質(zhì)，以胞核明顯，蛋白水平的變化受到細(xì)胞氧分壓的調(diào)節(jié)，在機(jī)體應(yīng)答缺氧并維持正常生理中處于核心環(huán)節(jié)，Cowden等[8]研究表明，HIF-1α在調(diào)節(jié)胎盤(pán)形成、胎盤(pán)細(xì)胞凋亡、血管發(fā)生等方面起著重要作用。

ICP作為一種主要影響胎兒及新生兒出生結(jié)局的妊娠特有的并發(fā)癥，臨床上以皮膚瘙癢和黃疸為特征，常引起早產(chǎn)、胎兒窘迫及死胎[9]，至今其病因及發(fā)病機(jī)制未明。有報(bào)道顯示，部分地區(qū)ICP發(fā)生率可高達(dá)13%，圍產(chǎn)兒病死率1.48‰～1.8‰[10，11]，我國(guó)長(zhǎng)江流域?yàn)镮CP高發(fā)區(qū)域。近年來(lái)眾多研究顯示，母體發(fā)病的相關(guān)因素與胎兒不良結(jié)局有著相關(guān)性，卻難以直接解釋胎兒不良結(jié)局，缺乏及時(shí)發(fā)現(xiàn)胎兒缺氧的預(yù)測(cè)指標(biāo)。胎盤(pán)是胎兒與母體之間唯一的連接器官，是維持胎兒在母體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)發(fā)育的的重要器官。研究發(fā)現(xiàn)，ICP患者血液中的高膽汁酸水平可能損害胎盤(pán)的物質(zhì)交換功能；損害胎盤(pán)結(jié)構(gòu)，使胎盤(pán)血容量下降，ICP胎盤(pán)發(fā)生絨毛間隙狹窄、合體結(jié)節(jié)增多等病理改變明顯增多。研究[12]及臨床實(shí)踐證明，ICP胎兒的缺氧是一個(gè)急性過(guò)程，多在臨產(chǎn)前突然發(fā)生，B超、胎心監(jiān)護(hù)等常規(guī)手段難以預(yù)測(cè)，是一個(gè)與宮縮有關(guān)的急性過(guò)程。

ICP胎盤(pán)的缺血缺氧與胎兒在子宮內(nèi)的急慢性缺氧密切相關(guān)，作為受缺氧調(diào)控的HIF-1α與ICP的關(guān)系日益受到重視。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ICP患者胎盤(pán)床細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)與正常對(duì)照組相比明顯升高，有顯著性差異（P﹤0.05），目前已有的研究[13，14]大都集中對(duì)胎盤(pán)組織的研究，對(duì)胎盤(pán)床的研究較少，國(guó)內(nèi)彭梅等[3]研究了子癇前期產(chǎn)婦胎盤(pán)床HIF-1α蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在子癇前期重度組胎盤(pán)床中的表達(dá)最高，可能在子癇前期的發(fā)生和發(fā)展中起作用，與本試驗(yàn)結(jié)果相似，但I(xiàn)CP相關(guān)文獻(xiàn)少見(jiàn)報(bào)道。ICP患者胎盤(pán)-胎兒系統(tǒng)存在缺氧，臨產(chǎn)時(shí)的每一次的強(qiáng)烈宮縮都是一次急性缺氧，多次重復(fù)的急性缺氧，使ICP胎盤(pán)更加缺血、缺氧，在慢性缺氧的基礎(chǔ)上并發(fā)急性缺氧可能是導(dǎo)致胎兒不良結(jié)局的原因。本結(jié)果表明，HIF-1α感受氧變化非常敏感，有可能是ICP患者急性缺氧的一個(gè)敏感指標(biāo)，是揭示ICP發(fā)病及造成胎兒不良結(jié)局的機(jī)制的重要因子。

綜上所述，HIF-1α與和ICP關(guān)系密切，在一定程度上參與了ICP胎兒缺氧的發(fā)生，HIF-1α在ICP胎盤(pán)床組織的高表達(dá)從蛋白水平證實(shí)HIF-1α可能是ICP胎兒缺氧的一個(gè)敏感指標(biāo)。臨床上ICP胎兒缺氧導(dǎo)致的不良結(jié)局危害性很大，但目前對(duì)早期發(fā)現(xiàn)胎兒缺氧仍無(wú)有效可靠的方法，對(duì)HIF-1α與ICP關(guān)系的進(jìn)一步研究有助于ICP合并胎兒窘迫的早期監(jiān)測(cè)，反映胎盤(pán)功能，從而改善圍生兒預(yù)后。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Pringle KG，Kind KL，Sferruzzi-Perri AN，et al. Beyond oxygen：complex regulation and activity of hypoxia inducible factors in pregnancy[J].Hum Reprod Update，2010，16（4）：415-431.

[2] Dunwoodie SL. The role of hypoxia in development of the Mammalian embryo[J]. Dev Cell，2009，17（6）：755-773.

[3] Peng M，Ding Y，Yu L，et al. Change of HIF-1 alpha protein expression in the placenta bed and concentration of vWF in maternal peripheral blood of pre-eclampsia[J]. Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2010，35（2）：134-139.

[4] Boeuf P，Tan A，Romagosa C，et al. Placental hypoxia during placental malaria[J]. J Infect Dis，2008，197（5）：757-765.

[5] 樂(lè)杰. 婦產(chǎn)科學(xué)[M]. 第7 版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：101-103.

[6] Dixon HG，Robertson WB. A study of the vessels of the placental bed in normotensive and hypertensive woman[J]. Obstet Gynaecol Br Emp，1985，65（1）：803-809.

[7] Roy A， Baby SM， Wilson DF，et al. Rat carotid body chemosensory discharge and glomus cell HIF-1 alpha expression in vitro： regulation by a common oxygen sensor[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2007，293（2）：829-836.

[8] Cowden Dahl KD，F(xiàn)ryer BH，Mack FA，et al. Hypoxia-inducible factors 1 alpha and 2 alpha regulate trophoblast differentiation[J]. Mol Cell Biol，2005，25（23）：10479-10491.

[9] Geenes VL，Lim YH， Bowman N，et al. A placental phenotype for intrahepatic cholestasis of pregnancy[J]. Placenta，2011，32（12）：1026-1032.

[10] He J， Chen L， Liang C. Clinical analysis of fetal death cases in intrahepatic cholestasis of pregnancy[J]. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi，2011，46（5）：333-337.

[11] Riely CA， Bacq Y. Intrahepatic cholestasis of pregnancy[J]. Clin Liver Dis，2004，8（1）：167-176.

[12] 張耀，劉淑蕓，王曉東. 妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥胎兒缺氧的因素[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2000，35（10）：600-602.

[13] 胡雅毅，劉淑蕓，劉冀成. 妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者胎盤(pán)上缺氧誘導(dǎo)因子-1α的研究[J]. 中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志（電子版），2006， 2（5）：254-256.

[14] 顧廣宇，錢(qián)志紅，蔣創(chuàng)，等. 缺氧誘導(dǎo)因子-1α在妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥胎盤(pán)組織的表達(dá)及意義[J]. 醫(yī)學(xué)信息，2009，22（9）：1798-1800.

（收稿日期：2013-03-20）