來曲唑通過cAMP—PKA信號通路影響子宮肌瘤細胞中MMP—2和TIMP—2的表達

[摘要] 目的 探討cAMP-PKA信號通路在來曲唑影響子宮肌瘤細胞中MMP-2和TIMP-2表達中的作用。 方法 cAMP-PKA信號通路抑制劑H-89（10 μmol/L）處理原代培養(yǎng)的人子宮肌瘤細胞30 min后，來曲唑（10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L）處理24、48和72 h。采用實時定量PCR和Western blot分別檢測MMP-2和TIMP-2 mRNA和蛋白的表達。 結果 來曲唑以濃度和時間依賴的方式下調(diào)了人子宮肌瘤細胞中MMP-2 mRNA和蛋白的表達，上調(diào)了TIMP-2 mRNA和蛋白的表達（P均< 0.05）。H-89部分取消了來曲唑誘導的人子宮肌瘤細胞中MMP-2表達的下調(diào)和TIMP-2表達的上調(diào)（P均< 0.05）。 結論 來曲唑通過cAMP-PKA信號通路影響子宮肌瘤細胞中MMP-2和TIMP-2的表達。

[關鍵詞] 來曲唑；子宮肌瘤細胞；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；金屬蛋白酶組織抑制因子-2；cAMP-PKA信號通路

[中圖分類號] R737.33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）16-0004-04

子宮肌瘤是育齡期女性最常見的生殖系統(tǒng)良性腫瘤，以月經(jīng)異常、陰道不規(guī)則流血、腹痛、子宮增大和臨近器官壓迫等為主要臨床癥狀[1]。子宮肌瘤的病因及發(fā)病機制十分復雜，目前還沒有闡明。目前的研究認為子宮肌瘤是一種依賴于激素的良性腫瘤[2]。芳香化酶是雌激素合成的關鍵酶，芳香化酶抑制劑可抑制雌激素的合成，降低體內(nèi)雌激素的水平，從而消除雌激素促進子宮肌瘤生長的作用。來曲唑是人工合成的第3代芳香化酶抑制劑，已被廣泛應用于腫瘤領域，其作用機制也不局限于雌激素途徑，在許多婦科疾病中都具有良好的應用前景[3，4]?；|(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）在細胞外基質(zhì)的降解中發(fā)揮著十分重要的作用。基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑-2（tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）能抑制MMP-2的活性[5]。細胞外基質(zhì)合成與降解之間的失衡在子宮肌瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。我們以前的研究結果顯示來曲唑能縮小子宮肌瘤患者肌瘤的體積，降低肌瘤組織中MMP-2的表達卻增加TIMP-2的表達[6]。cAMP-PKA信號通路是調(diào)節(jié)MMP表達的重要途徑[7]。因此本研究旨在探討cAMP-PKA信號通路在來曲唑下調(diào)MMP-2的表達和上調(diào)TIMP-2的表達中的作用，為來曲唑在子宮肌瘤的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）和來曲唑原藥（美國Sigma公司）。小牛血清（杭州四季青），DMEM培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司），CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司）和流式細胞儀（美國Beckman公司）。ABI7500熒光定量PCR儀及分析軟件（美國ABI公司）；GOS7500型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國UVP公司）；垂直電泳儀（美國BioRad公司）；轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國BioRad公司）。兔抗人α-actin、β-actin、MMP-2和TIMP-2抗體和辣根過氧化物酶標記的二抗（美國Santa Cruz公司），引物由上海生工提供。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗標本采集和細胞培養(yǎng) 選擇年齡在35～45歲之間的子宮肌瘤患者，術后經(jīng)病理切片確診為子宮肌瘤。將手術中切下的子宮肌瘤在無菌條件下取約1 cm3的肌瘤組織，PBS清洗肌瘤組織3遍，然后將肌瘤組織剪成碎片，加入含有Ⅰ型膠原酶（800 U/mL）的DMEM培養(yǎng)液，在37℃下消化5 h。吸取少量消化液滴于玻片上，用倒置顯微鏡觀察。當出現(xiàn)組織塊已經(jīng)消化成分散的小的細胞團或成單個細胞，加入含有小牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化。收集細胞，制成細胞懸液，用不銹鋼網(wǎng)過濾。收集濾液，2 000 r/min離心10 min，吸掉上清，收集細胞。將細胞接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)24 h。用顯微鏡觀察細胞生長情況，可見子宮肌瘤細胞貼壁生長。由于子宮肌瘤細胞具有貼壁生長的特性，倒掉培養(yǎng)基并換液而去掉未貼壁的細胞，從而分離子宮肌瘤細胞。當細胞生長達到80%～90%融合度時進行細胞傳代。臺盼藍染色后觀察細胞活性并進行細胞計數(shù)。細胞接種于24 孔細胞培養(yǎng)板，細胞密度為5×105個細胞/mL培養(yǎng)基。子宮肌瘤細胞的鑒定方法為免疫細胞化學法，采用抗體為α-actin抗體。呈對數(shù)生長且生長狀態(tài)穩(wěn)定的細胞用于以后的實驗。

1.2.2 實驗分組 將子宮肌瘤細胞分為以下實驗組：①單獨子宮肌瘤細胞組：在DMEM培養(yǎng)液中加入與其他實驗組相同量的DMSO；②來曲唑（10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L）處理48 h或來曲唑（10-6 mol/L）處理24、48和72 h組：來曲唑用DMSO溶解，DMSO在培養(yǎng)液中的濃度控制在0.1%以內(nèi)；③cAMP-PKA信號通路抑制劑H-89組：在培養(yǎng)基中加入H-89使其終濃度為10 μmol/L；④來曲唑+H-89組：在培養(yǎng)基中加入H-89使其終濃度為10 μmol/L，預處理30 min后，加入來曲唑處理。

1.2.3 Real-time PCR 處理時間結束后，收集各組細胞，一步法采用Trizol試劑盒提取各實驗組細胞的總RNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA的完整性。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄反應，把所提取的RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA，-20℃條件下保存?zhèn)溆?。cDNA樣品按梯度稀釋，然后進行PCR反應。反應體系包含PCR上下游引物各0.5 μL，10 μmol/L探針0.5 μL，2×Hot Star Taq Master Mix 12.5 μL，cDNA 4 μL，總反應體系為30 μL，余下部分用滅菌去離子水補足。引物由上海生工生物工程公司合成，MMP-2引物上游序列為：5′-TCTGGTCCCTTGCAGCTAGT-3′，下游序列為：5′-TGGGACAAGAACCAGATCAC-3′；TIMP-2引物上游序列為：5′-ATCAGGGccAAAGDGGTCAGTG-3′，下游序列為：5′-GTCACAGAGGGTGATGTGCAT-3′。同時擴增β-actin，作為實驗內(nèi)參，β-actin引物上游序列為：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCCTTAT-3′，下游序列為：5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。PCR擴增反應程序為：95℃ 10 min預變性，激活Hot Star Taq DNA合成酶，94℃變性50 s，60℃退火80 s，72℃延伸60 s，循環(huán)35個。實時定量PCR數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進行分析，以對照組為100%對目的基因的mRNA表達水平進行分析。

1.2.4 Western blot 處理時間結束后，收集各實驗組細胞，加入500 μL蛋白裂解液裂解細胞30 min，提取各組細胞的總蛋白。BAC法按試劑盒說明進行操作，測定裂解液蛋白質(zhì)的濃度。取50 μg蛋白樣本加入2×SDS加樣緩沖液中，煮沸，充分變性蛋白質(zhì)。6%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h而分離蛋白，電泳電壓為80 mV。將分離的蛋白轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙稀膜上，然后采用麗春紅染色法觀察蛋白轉(zhuǎn)移效果，并確定蛋白分子量標準的位置。用5%脫脂牛奶在室溫下孵育膜2 h，將非特異性抗原封閉。分別加入兔抗人MMP-2（1：150）、TIMP-2（1：150）和β-actin（1：200）的抗體，4℃下過夜。用TBST洗膜3次，每次洗5 min。加入羊抗兔二抗，二抗用辣根過氧化物酶標記，4℃下孵育膜4 h，然后用TBST沖洗3次。按照試劑盒說明書的指導，采用蛋白質(zhì)印跡檢測試劑盒將蛋白質(zhì)條帶顯示于X光片上，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描膠片并對結果進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)均采用x±s表示，采用單因素方差分析比較組間差異；組間差異的兩兩比較采用SNK-q檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 來曲唑?qū)θ俗訉m肌瘤細胞中MMP-2和TIMP-2表達的影響

來曲唑（10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L）處理人子宮肌瘤細胞48 h或來曲唑（10-6 mol/L）處理人子宮肌瘤細胞24、48和72 h后，采用實時定量PCR和Western blot分別檢測人子宮肌瘤細胞中MMP-2和TIMP-2 mRNA和蛋白的表達。結果如表1、表2和圖1所示，來曲唑以濃度和時間依賴的方式下調(diào)了人子宮肌瘤細胞中MMP-2 mRNA和蛋白的表達，同時以濃度和時間依賴的方式上調(diào)了人子宮肌瘤細胞中TIMP-2 mRNA和蛋白的表達（實驗組與相應對照組之間、實驗組不同濃度之間以及實驗組相同濃度不同處理時間之間比較差異有顯著性，P值均<0.05）。

來曲唑（10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L）處理人子宮肌瘤細胞48 h后，采用實時定量PCR和Western blot分別檢測人子宮肌瘤細胞中MMP-2 mRNA和蛋白的表達。所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，n = 3（表1）。

來曲唑（10-6 mol/L）處理人子宮肌瘤細胞24、48和72 h后，采用實時定量PCR和Western blot分別檢測人子宮肌瘤細胞中MMP-2 mRNA和蛋白的表達。所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，n = 3（表2）。

2.2 cAMP-PKA信號通路抑制劑H-89部分阻斷了來曲唑的作用

cAMP-PKA信號通路抑制劑H-89（10 μmol/L）預處理30 min后，加入來曲唑（10-6 mol/L）處理48 h。采用實時定量PCR和Western blot分別檢測人子宮肌瘤細胞中MMP-2和TIMP-2 mRNA和蛋白的表達。結果如圖2和圖3所示：H-89部分取消了由來曲唑誘導的人子宮肌瘤細胞中MMP-2 mRNA[q（來曲唑與來曲唑+H-89組）=6.04，P < 0.05]和蛋白[q（來曲唑與來曲唑+H-89組）=6.23，P < 0.05]表達的下調(diào)和TIMP-2 mRNA[q（來曲唑與來曲唑+H-89組）=5.76，P < 0.05]和蛋白[q（來曲唑與來曲唑+H-89組）=5.89，P < 0.05]表達的上調(diào)。

cAMP-PKA信號通路抑制劑H-89（10 μmol/L）預處理30 min后，加入來曲唑（10-6 mol/L）處理48 h。采用實時定量PCR和Western blot分別檢測人子宮肌瘤細胞中MMP-2 mRNA和蛋白的表達。（A）：實時定量PCR技術顯示人子宮肌瘤細胞中MMP-2 mRNA表達水平的統(tǒng)計圖；（B）：Blot技術顯示MMP-2蛋白表達水平；（C）：MMP-2蛋白表達水平的統(tǒng)計圖。所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，n = 3。*P < 0.05，與對照組比較；#P < 0.05，與來曲唑組比較（圖2）。

cAMP-PKA信號通路抑制劑H-89（10 μmol/L）預處理30 min后，加入來曲唑（10-6 mol/L）處理48 h。采用實時定量PCR和Western blot分別檢測人子宮肌瘤細胞中TIMP-2 mRNA和蛋白的表達。（A）：實時定量PCR技術顯示人子宮肌瘤細胞中TIMP-2 mRNA表達水平的統(tǒng)計圖；（B）：Blot技術顯示TIMP-2蛋白表達水平；（C）：TIMP-2蛋白表達水平的統(tǒng)計圖。所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，n = 3。*P < 0.05，與對照組比較；#P < 0.05，與來曲唑組比較（圖3）。

3 討論

子宮肌瘤是育齡期婦女生殖器系統(tǒng)最常見的良性腫瘤之一。目前手術切除是子宮肌瘤的主要治療手段，因此子宮肌瘤是導致子宮切除的主要原因之一，嚴重危害了育齡婦女的身心健康，因此尋找新的治療途徑具有十分重要的意義。子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展的分子生物學基礎尚不完全清楚，目前大多數(shù)研究者認為子宮肌瘤是一種依賴激素的疾病。

芳香化酶是合成雌激素的限速酶，該酶活性的抑制可阻斷雌激素合成。來曲唑是一種非甾體類具有高度特異性的第3代芳香化酶抑制劑，也是一種人工合成的三苯三唑類衍生物[8]。來曲唑與芳香化酶內(nèi)源性底物之間具有競爭抑制，來曲唑與芳香化酶的活性位點可逆性結合后，抑制該酶的活性，減少雌激素的合成，因此臨床上來曲唑可用來治療依賴雌激素的疾病。有研究表明子宮肌瘤患者連續(xù)使用來曲唑（5 mg/d）12周后，子宮肌瘤體積減小的幅度達70%[9]。

MMP是一種依賴Zn2+的內(nèi)肽酶，也是機體內(nèi)重要的細胞外基質(zhì)降解酶。MMP通過降解細胞外基質(zhì)在傷口的愈合、胎兒的分娩以及腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要的作用。MMP-2是MMP中降解細胞外基質(zhì)最重要的一種酶[10]。MMP的組織型抑制劑可1：1與MMP共價結合，從而抑制MMP的活性，是一種MMP的天然抑制因子。MMP和TIMP共同維持著細胞外基質(zhì)的降解與合成之間的平衡。有研究發(fā)現(xiàn)MMP-2可以直接降解細胞外基質(zhì)中的膠原，也可以間接激活其他MMP，降解細胞外基質(zhì)，使基底膜遭到破壞，從而使子宮肌瘤進一步生長，參與了子宮肌瘤的發(fā)生和發(fā)展[11]。研究表明子宮肌瘤組織中MMP-2的表達顯著高于正常子宮平滑肌組織而TIMP-2在子宮肌瘤組織中的表達也顯著低于正常子宮平滑肌組織[12]。

在我們的研究中，結果顯示來曲唑以濃度和時間依賴的方式下調(diào)了人子宮肌瘤細胞中MMP-2 mRNA和蛋白的表達，卻上調(diào)了人子宮肌瘤細胞中TIMP-2 mRNA和蛋白的表達。這些結果表明來曲唑減小肌瘤體積，改善子宮肌瘤患者的臨床癥狀可能與來曲唑下調(diào)子宮肌瘤細胞中MMP-2的表達和上調(diào)子宮肌瘤細胞中TIMP-2的表達有關。MMP-2和TIMP-2表達的調(diào)控涉及到多條信號通路，如cAMP-PKA途徑、Ras途徑和MAPK途徑等[13]，我們的結果顯示cAMP-PKA信號通路抑制劑H-89部分取消了來曲唑誘導的人子宮肌瘤細胞中MMP-2表達的下調(diào)和TIMP-2表達。這些結果表明來曲唑影響MMP-2和TIMP-2的表達可能涉及到cAMP-PKA信號通路。

總之，我們的研究證實來曲唑降低了人子宮肌瘤細胞中MMP-2表達和上調(diào)了TIMP-2的表達，其機制可能與cAMP-PKA信號通路激活有關。

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（收稿日期：2013-02-19）