Nrf2—ARE信號通路在外傷性腦損傷神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制研究

[摘要] 目的 初步探討Nrf2-ARE通路在外傷性腦損傷保護(hù)作用的機(jī)制。 方法 采用基因敲除大鼠制作創(chuàng)傷性腦損傷模型。將72只實(shí)驗(yàn)大鼠分為假手術(shù)組（Nrf2+/+）、腦損傷組（Nrf2+/+）、假手術(shù)組（Nrf2-/-）和腦損傷組（Nrf2-/-），每組18只。損傷36 h后，采用TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡及ELISA蛋白羰基試劑盒檢測蛋白質(zhì)氧化損傷程度。 結(jié)果 假手術(shù)組（Nrf2+/+）大鼠與假手術(shù)組（Nrf2-/-）大鼠相比，腦組織蛋白羰基濃度及神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均無顯著差異（P > 0.05）；而腦損傷組（Nrf2+/+）大鼠及腦損傷組（Nrf2-/-）大鼠的腦組織蛋白羰基濃度及神經(jīng)細(xì)胞凋亡率分別比假手術(shù)組（Nrf2+/+）大鼠與假手術(shù)組（Nrf2-/-）大鼠高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），但腦損傷組（Nrf2-/-）大鼠的相關(guān)指標(biāo)較腦損傷組（Nrf2+/+）明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 Nrf2-ARE通路可能通過減低外傷性腦損傷中腦組織蛋白羰基的濃度，減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 外傷性腦損傷；Nrf2-ARE通路；氧化應(yīng)激；神經(jīng)保護(hù)

[中圖分類號] R651.1+5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）11-0011-03

外傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）指由外傷因素所致嚴(yán)重腦組織損害的一類疾病，已嚴(yán)重影響人類的健康[1]。其中，TBI后神經(jīng)元繼發(fā)性損傷（secondary brain injury，SBI）是造成腦損傷發(fā)生、發(fā)展的重要原因[2]。近年來，有研究者認(rèn)為氧化應(yīng)激損傷在外傷性腦損傷機(jī)制中占有重要的地位[3]。有研究結(jié)果表明Nrf2-ARE通路可能參與了TBI后內(nèi)源性應(yīng)激防御機(jī)制[4，5]，但其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制尚未得到完全闡明。因此，本研究采用外傷性腦損傷大鼠模型，觀察Nrf2-ARE通路對TBI后大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)的作用，探討該通路在TBI后發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

（Nrf2-/-）大鼠及（Nrf2+/+）大鼠由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。其中，前者DNA基因的引物序列為5’-GCGGATTGACCGTAATGGATAGG-3’，而后者DNA基因的引物序列為5’-CGCCTTTTCAGTAGATGGAGG-3’。所有大鼠均在自由飲食條件下飼養(yǎng)。

1.2 試劑和儀器

原位末端標(biāo)記（TUNEL）試劑盒（Promega公司）；ProteinCarbonyls ELISA Kit試劑盒（RD Systems公司，美國）；多功能酶標(biāo)儀（BioTek 公司，美國）；Labo fuge 400R高速離心機(jī)（Heraeus公司，德國）；電子顯微鏡（OLYMPUS，日本）等。

1.3 動(dòng)物模型制備及大鼠分組

采用BenchmarkTM法制備TBI動(dòng)物模型[6]。過程如下：麻醉成功后，暴露顱骨。距矢狀縫中線右1 mm，在人字縫與冠狀縫處鉆孔，直徑約0.4 cm，打開硬腦膜。將撞擊器裝配在立體定位儀上，將撞擊器的頭端與冠狀面平行，而與大鼠頭顱矢狀面呈8°角度垂直固定于硬腦膜上。采用2.5 mm直徑的撞擊頭，以3.5 m/s撞擊速度、0.8 mm打擊深度、90 ms打擊時(shí)間制作中度外傷性腦損傷。假手術(shù)組大鼠無沖擊損傷過程，其余步驟同模型組。將基因敲除大鼠分四組：假手術(shù)組（Nrf2+/+組）、腦損傷組（Nrf2+/+組）、假手術(shù)組（Nrf2-/-組）和腦損傷組（Nrf2-/-組），每組18只。18只大鼠均在損傷36 h后處死，其中9只取右側(cè)損傷灶腦組織，-70℃冰箱保存，待腦組織蛋白羰基的濃度檢測；其余9只行TUNEL染色并在光鏡下（×400）觀察凋亡細(xì)胞。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 組織蛋白羰基濃度測定 嚴(yán)格按ProteinCarbonyls ELISA試劑盒步驟說明書操作測定。

1.4.2 TUNEL染色 嚴(yán)格按照試劑盒檢測步驟進(jìn)行操作。TUNEL染色在光鏡下（×400）觀察凋亡細(xì)胞（以胞核出現(xiàn)棕黃染色顆粒代表），計(jì)算TUNEL陽性率即TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比值并采圖。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，所有數(shù)據(jù)均以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，相同基因型或不同基因型間兩兩比較均采用配對t檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織蛋白羰基濃度比較

3 討論

有研究表明，Nrf2作為一個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，對防御各種內(nèi)源性應(yīng)激損傷起到積極的調(diào)控作用且廣泛分布于機(jī)體的各個(gè)組織器官中[7]。Nrf2屬于CNC轉(zhuǎn)錄因子家族成員。CNC家族除Nrf2外，還包括P45、Nrf1和Nrf3，而其中Nrf2為細(xì)胞防御各種應(yīng)激損傷的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[8，9]。有研究報(bào)道，位于Ⅱ相解毒酶基因分子順式作用元件的其中一段增強(qiáng)子序列的5’端中含有一個(gè)抗氧化反應(yīng)基團(tuán)，Nrf2-Maf異二聚體可與此處結(jié)合以增強(qiáng)其下游靶基因的表達(dá)，從而構(gòu)成Nrf2誘導(dǎo)Ⅱ相酶基因表達(dá)的必需調(diào)節(jié)因子[10]。當(dāng)受到活性氧或親電子物質(zhì)的信號攻擊后，Nrf2被磷酸化后從復(fù)合物中解離[11]，構(gòu)成新異二聚體后又與抗氧化反應(yīng)元件ARE上GCTGAGTCA位點(diǎn)結(jié)合，使下游靶基因的表達(dá)得以激活，進(jìn)一步調(diào)節(jié)抗氧化酶蛋白，相繼啟動(dòng)ARE作用的抗氧化酶基因及Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，如HO-1、NQO-1等，從而發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。最近，已有研究證實(shí)Nrf2-ARE通路在中樞神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)揮內(nèi)源性抗氧化作用來減輕氧化應(yīng)激所致的神經(jīng)元損傷。但該通路是否具有保護(hù)腦外傷后的神經(jīng)細(xì)胞的作用及其相關(guān)機(jī)制尚不明確。為盡量減少藥理學(xué)局限性的干擾，更準(zhǔn)確地了解Nrf2-ARE通路在外傷性腦損傷中的保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞作用及其機(jī)制，本研究采用Nrf2基因敲除大鼠對Nrf2在外傷性腦損傷中的作用及機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

目前認(rèn)為，在外傷性腦損傷的發(fā)生、發(fā)展的過程中，繼發(fā)性損傷是非常重要的因素，它也是顱腦外傷后造成患者死亡和影響后續(xù)康復(fù)的主要原因。為此，積極治療繼發(fā)性腦損傷對于搶救患者的生命及改善預(yù)后具有積極的意義。本研究中從病理形態(tài)學(xué)（細(xì)胞凋亡）客觀地評價(jià)繼發(fā)性腦損傷。我們發(fā)現(xiàn)，腦損傷組（Nrf2+/+）及腦損傷組（Nrf2-/-）大鼠都出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，但后者較前者表現(xiàn)得更為嚴(yán)重，這提示Nrf2對外傷性腦損傷具有抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。這與既往研究報(bào)道中Nrf2可減少腦損傷的體積及改善急性腦血管病的神經(jīng)細(xì)胞功能結(jié)果相一致[6，12]。

除此之外，我們還發(fā)現(xiàn)Nrf2-ARE通路對外傷性腦損傷后抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用與其抑制氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。有研究表明，氧自由基在外傷性腦損傷后繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生、發(fā)展過程中起到了非常重要的作用。腦細(xì)胞損傷后，產(chǎn)生了大量的氧自由基，其一可直接使蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及DNA過氧化，破壞細(xì)胞膜磷脂結(jié)構(gòu)，促使蛋白質(zhì)的降解、核酸主鏈的斷裂、細(xì)胞的崩解及細(xì)胞發(fā)生一系列不可逆的病理改變；其二可通過刺激表達(dá)黏附分子和細(xì)胞因子，進(jìn)一步介導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)過程，從而加重受損的腦組織細(xì)胞功能損傷；其三，氧自由基還可通過抑制線粒體功能等間接途徑使凋亡信號通路得以激活，引起神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[13]。上述環(huán)節(jié)互相影響、相互重疊，成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞不可逆性壞死。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，腦損傷組（Nrf2+/+）及腦損傷組（Nrf2-/-）大鼠損傷側(cè)周邊腦組織中蛋白質(zhì)氧化損傷指標(biāo)（蛋白羰基）的表達(dá)明顯增高，故提示腦組織中出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，同時(shí)損傷側(cè)腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡率也明顯升高，這與以往的研究也是相一致的，在一定程度上說明外傷性腦損傷后發(fā)生明顯氧化應(yīng)激損傷，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。但腦損傷組（Nrf2+/+）及腦損傷組（Nrf2-/-）大鼠相比，后者氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡率較前者更加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。既往研究也證實(shí)，Nrf2對新生兒缺氧性腦病、腦出血以及腦缺血后氧化應(yīng)激及神經(jīng)元損傷都具有保護(hù)性意義[14]，與本研究結(jié)果相一致。由此，我們認(rèn)為Nrf2-ARE通路對于抑制外傷性腦損傷后氧化應(yīng)激損傷，抗細(xì)胞凋亡具有十分重要的意義。

綜上所述，本研究通過Nrf2敲除大鼠建立外傷性腦損傷模型，證實(shí)Nrf2-ARE通路在外傷性腦損傷中發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用。其機(jī)制可能是通過抑制氧化應(yīng)激損傷來實(shí)現(xiàn)，這為今后積極治療外傷性腦損傷帶來新策略奠定重要的理論基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Reilly P. The impact of neurotrauma on society： an international perspeetive[J]. Prog Brain Res，2007，161：3-9.

[2] Jennett B. Epidemiology of head injury[J]. J Neurol Neurosurg Psychiatry，1996，60（4）：362-369.

[3] Darwish RS，Amiridze N，Aarabi B. Nitrotyrosine as an oxidative stress marker： evidence for involvement in neurologic outcome in human traumatic brain injury[J]. J Trauma，2007，63（2）：439-442.

[4] Ikeda Y，Long DM. The molecular basic of brain injury and brain edema：the role of oxygen free radicals[J]. Neurosurgery，1990，27（1）：1-11.

[5] Clausen F，Lundqvist H，Ermark S，et al. Oxygen free radical dependent activation of extracellular signal-regulated kinase mediates apoptosis-likecell death after traumatic brain injury[J]. J Neurotrauma，2004，21（9）：1168-1182.

[6] Brody DL，Mac Donald C，Kessens CC，et al. Electromagnetic controlled cortical impact device for precise，graded experimental traumatic brain injury[J]. J Neurotrauma，2007，24（4）：657-673.

[7] Owuor ED，Kong AN. Antioxidants and oxidants regulated signal transduction pathways[J]. Biochem Pharmacol，2002，64（5-6）：765-770.

[8] Itoh K，Chiba T，Takahashi S，et al. An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase Ⅱ detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements[J]. Biochem Biophys Res Commun，1997， 236（2）：313-322.

[9] Kobayashi A，Ohta T，Yamamoto M. Unique function of the Nrf2-Keap1 pathway in the inducible expression of antioxidant and detoxifying enzymes[J]. Methods Enzymol，2004，378：273-286.

[10] Motohashi H，Yamamoto M. Nrf2-Keap1 defines a physiologically important stress response mechanism[J]. Trends Mol Med，2004，10（11）：549-557.

[11] McMahon M，Itoh K，Yamamoto M，et al. Keap1-dependent proteasomal degradation of transcription factor Nrf2 contributes to the negative regulation of antioxidant response element-driven gene expression[J]. J Biol Chem，2003，278（24）：21592-21600.

[12] Zhao X，Sun G，Zhang J，et al. Transcription factor Nrf2 protects the brain from damage produced by intracerebral hemorrhage[J]. Stroke，2007，38（12）：3280-3286.

[13] Chong ZZ，Li F，Maiese K. Oxidative stress in the brain： novel cellular targets that govern survival during neurodegenerative disease[J]. Prog Neurobiol，2005，75（3）：207-246.

[14] Ping Z，Liu W，Kang Z，et al. Sulforaphane protects brains against hypoxic-ischemic injury through induction of Nrf2-dependent phase 2 enzyme[J]. Brain Res，2010，1343：178-185.

（收稿日期：2013-01-18）