免疫組化質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)化管理

[摘要] 探討免疫組化室內(nèi)質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)化管理，根據(jù)本科室免疫組化質(zhì)量控制管理實(shí)際，從實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)中、實(shí)驗(yàn)后三方面闡述免疫組化質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)化管理細(xì)則，總結(jié)在實(shí)驗(yàn)過程中的經(jīng)驗(yàn)和體會(huì)，提高免疫組化檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

[關(guān)鍵詞] 免疫組化；質(zhì)量控制；標(biāo)準(zhǔn)化管理

[中圖分類號(hào)] R446.8 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] C [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）31-0134-03

免疫組化染色技術(shù)在現(xiàn)代病理診斷中的應(yīng)用日益廣泛， 對各類腫瘤的確診及鑒別診斷具有重要意義，而且在腫瘤患者個(gè)體化治療、靶向治療方案的選擇及預(yù)后判斷方面越來越受到臨床醫(yī)生的青睞，已經(jīng)成為病理診斷中不可或缺的輔助手段[1]。因而很多單位，包括基層醫(yī)院也開展了這個(gè)項(xiàng)目。隨之而來的是，免疫組化質(zhì)量控制問題也凸顯出來了。這其中有實(shí)驗(yàn)員操作不當(dāng)?shù)囊蛩?，也有其他的因素，如組織固定不好、試劑效價(jià)和試劑盒質(zhì)量問題等等，各免疫組化實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理水平參差不齊[2，3]。目前國內(nèi)尚無免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化管理的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，因而在眾多繁雜的條件中，探索找到一個(gè)相對穩(wěn)定的免疫組化質(zhì)量控制的條件，即所謂的標(biāo)準(zhǔn)化管理方法具有重要意義。筆者根據(jù)本科室的實(shí)際情況，總結(jié)免疫組化室內(nèi)質(zhì)控管理的一點(diǎn)心得體會(huì)，從實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)中、實(shí)驗(yàn)后三方面淺談免疫組化室內(nèi)質(zhì)量控制如何實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化管理。

1實(shí)驗(yàn)前的標(biāo)準(zhǔn)化管理

1.1 組織處理的標(biāo)準(zhǔn)化

組織處理得當(dāng)是成功制片的關(guān)鍵，對免疫組化染色結(jié)果的影響尤其重要，主要包括取材、固定、脫水等環(huán)節(jié)。如果組織處理不良，那么在其后的任何階段均難以補(bǔ)救。組織或細(xì)胞固定的目的是使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，終止或減少外源性或內(nèi)源性酶的反應(yīng)，防止細(xì)胞自溶，以保持組織細(xì)胞的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)，更重要的是保存組織或細(xì)胞的抗原性，防止抗原的丟失或彌散。因此，標(biāo)本應(yīng)盡可能保持新鮮并及時(shí)進(jìn)行固定。我們科室積極與臨床一線溝通，宣傳固定的意義、方法和要求，擬定以下標(biāo)準(zhǔn)：手術(shù)標(biāo)本離體后30分鐘內(nèi)，用10%中性緩沖福爾馬林固定。固定時(shí)間為小標(biāo)本6～12 h，大標(biāo)本12～24 h。組織取材厚度為3～4 mm，放入全自動(dòng)脫水機(jī)進(jìn)行脫水[4]。組織處理不好對抗原修復(fù)也產(chǎn)生影響，熱修復(fù)時(shí)脫片的概率將會(huì)增大。

1.2 免疫組化切片的標(biāo)準(zhǔn)化

1.2.1 玻片處理及切片厚度 用于免疫組化的玻片一般都需要進(jìn)行防脫片涂膠處理，目前常用的有氨丙基三乙氧基硅烷和L-多聚賴氨酸，防脫片的效果對比其他粘附劑都要好[5]。我們采用的是L-多聚賴氨酸，效果很好。采用3～4 μm連續(xù)切片[6]，切片厚度不能過于求薄，太薄由于抗原的減少，會(huì)導(dǎo)致抗體陽性表達(dá)的減弱，也不宜太厚，太厚在熱修復(fù)過程中容易導(dǎo)致脫片。

1.2.2 抗原修復(fù)方法 福爾馬林固定組織導(dǎo)致組織中抗原決定簇封閉，也就是組織細(xì)胞經(jīng)福爾馬林固定后，導(dǎo)致抗原決定簇的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變，使抗原決定簇被掩蓋或原來位于表面的一些抗原決定簇因折疊而形成隱蔽的抗原決定簇，因此抗原的理化性質(zhì)發(fā)生了顯著的變化，表位空間結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致許多抗原免疫活性丟失。但這一變化是可逆的，可通過抗原修復(fù)。目前抗原修復(fù)有兩種方法：酶消化法和熱修復(fù)法。

抗原修復(fù)方法的選擇關(guān)系到組織抗原能否暴露充分，這對免疫組化染色結(jié)果有很大影響。有很多文獻(xiàn)比較了各種抗原修復(fù)方法的優(yōu)劣，目前，被認(rèn)為效果最好、最常用的修復(fù)方式為高壓加熱修復(fù)[7-9]。我們將微波加熱與高壓加熱的方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)陽性定位于細(xì)胞核的抗體，如P53、Ki-67等的核表達(dá)，在高壓修復(fù)后明顯強(qiáng)于微波修復(fù)，因此我們選擇高壓加熱修復(fù)，抗原修復(fù)液為檸檬酸鹽，修復(fù)時(shí)間為高壓鍋出氣后2 min自然冷卻，時(shí)間過短，抗原暴露不夠，時(shí)間過長，導(dǎo)致背景過深。

1.2.3 抗原修復(fù)液的選擇 加熱抗原修復(fù)緩沖液有多種如檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）、Tris（pH7～8）、EDTA（pH8.0）等，目前首選檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0），優(yōu)點(diǎn)是染色背景清晰， 適合于大多數(shù)抗體。Tris和EDTA兩種修復(fù)液對部分抗原修復(fù)效果較強(qiáng)，但其染色背景同時(shí)加深，如使用不當(dāng)易造成假陽性結(jié)果。值得注意的是，沒有一種抗原修復(fù)液能適合于所有的抗體，檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）可作為免疫組化常規(guī)使用的抗原修復(fù)緩沖液，但也不能除外某些抗體適于用EDTA和Tris緩沖修復(fù)液。一般抗原比較難于表達(dá)的抗體多選擇后兩者。

1.3 試劑管理的標(biāo)準(zhǔn)化

1.3.1 試劑清單及使用記錄的管理 試劑的種類、公司有很多，為了方便管理，我們創(chuàng)建了一個(gè)“免疫組化試劑登記表”Excel電子表格，進(jìn)行試劑清單的管理，簡潔又規(guī)范（圖1）。登記表的內(nèi)容包括抗體名稱、類型、稀釋度、是否修復(fù)、克隆號(hào)、編號(hào)、批號(hào)、公司名稱、庫存量、有效期、接收日期、啟用日期、用完日期等，也可以根據(jù)各單位實(shí)際情況自己添加內(nèi)容。所有試劑應(yīng)保證在有效期內(nèi)使用，只有這樣才能確?？贵w的效價(jià)。因此，登記表中有效期、用完日期的記錄要求完整準(zhǔn)確，過期試劑或者失效試劑應(yīng)丟棄不用，并備注原因。每種試劑的使用情況都要記錄在案（圖2），與圖1表格建立超鏈接。下圖1為本科室免疫組化試劑登記表部分的截圖，利用Excel條件格式將不同字體顏色顯示不同指代意義，如紅色提示超過有效期等。

圖1 免疫組化試劑登記表（部分）

圖2 試劑盒使用記錄表（圖1中超鏈接）

1.3.2 冰箱溫度控制及試劑的擺放 所有的試劑均應(yīng)在試劑公司建議的溫度下保存，儲(chǔ)存試劑的冰箱應(yīng)每天檢查，建立一個(gè)冷藏冰箱溫度監(jiān)測表，并按時(shí)記錄溫度值。不管是濃縮型還是即用型試劑，如果是一堆地放在冰箱里，要用或配置的時(shí)候找起來比較麻煩費(fèi)事，我們自己設(shè)計(jì)制做了幾個(gè)試劑擺放的木架子，將免疫組化試劑按首字母A→Z排列，同系列的按數(shù)字從小到大依次排列，如Actin、AFP、Bcl-2、CA125、CD10、CD117等依次排列（如圖3所示），這樣找試劑比原來方便許多，節(jié)省時(shí)間，看起來也比較整潔。

圖3 試劑的擺放

圖4 陽性與陰性對照

1.3.3試劑配置 免疫組化的試劑分為即用型和濃縮型兩種，濃縮試劑的配置，需要對抗體滴度（稀釋比）進(jìn)行評估。我們參考公司推薦的抗體滴度，在其前后各增加一個(gè)實(shí)驗(yàn)滴度，如公司推薦1∶200，我們配置1∶100、1∶200、1∶400三種滴度，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以觀察陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度及非特異性染色，驗(yàn)證試劑的可靠滴度，然后才能在常規(guī)的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用。

2實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)化管理

2.1 檢測方法的選擇

免疫組化的檢測方法有很多種，大致分為生物素型和非生物素型兩大類。因組織中含有內(nèi)源性生物素，所以會(huì)干擾免疫組化的染色結(jié)果，在生物素型檢測方法的操作過程中，要阻斷內(nèi)源性生物素干擾。非生物素型聚合物檢測，可以有效地防止內(nèi)源性生物素的影響，并且靈敏度高，操作簡便，為很多實(shí)驗(yàn)室采用，是目前免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化染色的首選方法。我們采用的是非生物素型EliVision二步法，檢測方法比較穩(wěn)定，效果也好。

2.2 免疫組化染色操作標(biāo)準(zhǔn)化

目前，免疫組化染色分手工操作和全自動(dòng)免疫組化儀操作。在手工染色過程中，或多或少要受到實(shí)驗(yàn)員個(gè)人因素的干擾。全自動(dòng)免疫組化儀的出現(xiàn)，避免了操作過程中人為因素的干擾，增加了染色結(jié)果的可靠性，有助于免疫組化質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)化管理。我們采用全自動(dòng)免疫組化儀進(jìn)行染色，與手工染色相比，具有以下技術(shù)優(yōu)勢：①精確的抗體孵育時(shí)間控制，確保染色質(zhì)量，避免背景非特異性著色。②精確的抗體濃度以及量的控制，避免因?qū)嶒?yàn)員手法不同而導(dǎo)致抗體濃度被稀釋，影響染色強(qiáng)度的表達(dá)，還可以避免交叉污染和非特異性染色的產(chǎn)生。③二維碼的識(shí)別，可以使滴加試劑的時(shí)候不會(huì)產(chǎn)生滴錯(cuò)的現(xiàn)象，避免人工滴加錯(cuò)誤，導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果的發(fā)生。④可根據(jù)實(shí)驗(yàn)員的工作需要，統(tǒng)籌安排，能更加合理高效地利用時(shí)間。⑤程序結(jié)束后可以保存整個(gè)進(jìn)程，如果出現(xiàn)問題，可以在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后復(fù)審，以便查找出問題的原因[10]。

2.3 陽性與陰性對照

每一次免疫組化染色必須嚴(yán)格設(shè)立陽性對照和陰性對照[11]。我們的方法是，每個(gè)抗體都備有一個(gè)陽性對照的小蠟塊，陽性對照小蠟塊的準(zhǔn)備：取材的同時(shí)，從大體標(biāo)本中重新取材，制作成大小約為0.4 cm×0.3 cm×0.3 cm的組織塊，一起脫水包埋。時(shí)間應(yīng)控制在48 h之內(nèi)，用以保存組織抗原；常規(guī)HE切片染色，鏡下觀察有癌組織后，進(jìn)行所需抗體表達(dá)測定，評估適合作為陽性對照后放置備用。陽性對照小蠟塊主要目的針對試劑的不同批次、重新配置、滴度預(yù)試驗(yàn)等，用來評估試劑的可靠度。在實(shí)驗(yàn)過程中將待測組織與陽性對照小蠟塊組織裱于同一張切片（圖4），PBS代替一抗作為陰性對照，然后進(jìn)行染色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更可靠、更節(jié)約成本，這一方法值得推廣應(yīng)用。

3實(shí)驗(yàn)后的標(biāo)準(zhǔn)化管理

3.1 染色結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)化

免疫組化切片應(yīng)是陽性標(biāo)記強(qiáng)而非特異性染色淡或無，兩者形成鮮明的對比，陽性表達(dá)必須在細(xì)胞或組織特定的部位，細(xì)胞邊界清楚；每批染色都要有陽性對照、陰性對照和自身對照才能對染色結(jié)果作出正確判斷。判斷標(biāo)準(zhǔn)常根據(jù)陽性細(xì)胞的百分比或陽性細(xì)胞的染色深度來判斷，其顏色深淺反映抗原量的多少。免疫組化染色結(jié)果還要結(jié)合組織形態(tài)學(xué)判斷是真正的陽性染色而非其他著色。陽性反應(yīng)分布總是有規(guī)律、局限、定位準(zhǔn)確和一定形態(tài)特征的，如細(xì)胞膜著色呈圓形；典型的細(xì)胞核著色為均質(zhì)狀，核仁和染色質(zhì)呈顆粒狀著色。細(xì)胞漿呈顆粒狀（位于細(xì)胞器）或纖維狀（中間絲或微絲）或彌漫片狀（細(xì)胞內(nèi)液、病毒顆粒及吸收蛋白）著色；細(xì)胞間質(zhì)呈纖維條塊狀著色；若陽性結(jié)果定位異常象征著疾病過程。非特異性著色為無規(guī)律、無界線、定位不準(zhǔn)確且不能重復(fù)；結(jié)締組織受染和內(nèi)源性生物素干擾是最常見的非特異性著色，鏡下為均勻細(xì)顆粒狀的淺棕色，但不會(huì)出現(xiàn)在細(xì)胞膜或細(xì)胞核。

由于免疫組化染色結(jié)果是定性指標(biāo)，不能定量，染色結(jié)果判斷受到診斷醫(yī)師的主觀因素影響而導(dǎo)致結(jié)果差異。為了減少這種差異的發(fā)生，我們科室內(nèi)部采用統(tǒng)一的免疫組化染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)格按照公認(rèn)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，如乳腺癌ER、PR采用Bessley分級(jí)法[12]，C-erbB-2采用美國臨床腫瘤協(xié)會(huì)（ASCO）/美國病理學(xué)家學(xué)院（CAP）HER2檢測指南等[13]。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的跟蹤、記錄

每批次的免疫組化結(jié)果，進(jìn)行質(zhì)量跟蹤記錄，對于特別異常的結(jié)果，應(yīng)該分析原因。是新購試劑，還是新配試劑，或者是操作過程中有無異常；全自動(dòng)免疫組化儀染色的可以把程序調(diào)出來復(fù)審，然后備注分析的原因，重新設(shè)立陽性對照再染色，觀察效果，直到問題解決為止。對于一些單位來說，配置的濃縮試劑，在經(jīng)過一段時(shí)間后，也要進(jìn)行陽性強(qiáng)度的評測，以防止配置時(shí)間過長后效價(jià)的降低，導(dǎo)致陽性強(qiáng)度的減弱。

3.3 試劑的庫存管理

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，需要在“免疫組化試劑登記表”中，對于使用的試劑進(jìn)行數(shù)據(jù)的更新，以便及時(shí)更換采購試劑。

3.4 實(shí)驗(yàn)室的清潔、整理

清潔工作場所內(nèi)的臟污，必要的東西分門別類以一定的順序放置，保持工作場所干凈、整潔。對于使用過的儀器，做好儀器的日常維護(hù)，記錄使用情況。另外，實(shí)驗(yàn)室的衛(wèi)生對于實(shí)驗(yàn)人員也有一定的安全保護(hù)作用。

4 討論

免疫組化質(zhì)量的好壞影響的因素方方面面。要確保免疫組化結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性，加強(qiáng)免疫組化室內(nèi)質(zhì)量控制管理，制定相應(yīng)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)尤其重要。筆者結(jié)合本科室的實(shí)際情況，對實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)中和實(shí)驗(yàn)后三個(gè)層面可能影響免疫組化染色結(jié)果的因素進(jìn)行分析、總結(jié)，制定本科室免疫組化室內(nèi)質(zhì)控管理相關(guān)細(xì)則，在日常工作實(shí)踐中得到檢驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)，標(biāo)本及時(shí)用10%中性福爾馬林固定，取材大小適當(dāng)，組織良好的脫水，切片的厚度適宜并做防脫片處理，選擇高壓熱修復(fù)，抗體效價(jià)的評估，采用全自動(dòng)免疫組化儀代替手工操作，并做陽性與陰性對照，依照公認(rèn)的免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn)等因素，是一個(gè)相對穩(wěn)定的免疫組化室內(nèi)質(zhì)量控制的條件。各個(gè)環(huán)節(jié)制定相應(yīng)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化管理目標(biāo)。另外每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)建有本實(shí)驗(yàn)室免疫組化檢測的SOP文件，所謂的SOP是指 Standard Operation Procedure三個(gè)單詞中首字母的大寫，即標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序，就是將某一事件的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟和要求以統(tǒng)一的格式描述出來，用來指導(dǎo)和規(guī)范日常的工作。定期做好實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)量控制，真正把SOP文件應(yīng)用到實(shí)際工作中去。每一個(gè)實(shí)驗(yàn)人員在進(jìn)行免疫組化操作的時(shí)候，也應(yīng)該有嚴(yán)肅的態(tài)度和高度的責(zé)任心，才能在制片過程中做到一絲不茍，才能做出優(yōu)秀的切片。制度化、規(guī)范化操作是實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作的前提條件[14，15]，全自動(dòng)免疫組化儀器的使用是必要手段，陽性和陰性對照的設(shè)立是結(jié)果可信的可靠保證，穩(wěn)定良好的染色質(zhì)量和可靠的結(jié)果判讀才是免疫組化質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)化管理的最終目的。

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（收稿日期：2013-06-21）