10種中藥對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的體外抑菌活性

[摘要] 目的 測定烏梅等10味中藥對產(chǎn)超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）大腸埃希菌的體外抑菌活性，明確其最低抑菌濃度（MIC），為臨床應用中藥治療產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌感染提供參考依據(jù)。 方法 各收集10株產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌，制備適當濃度的各種中藥煎液備用。采用瓊脂稀釋法進行定量抑菌試驗，分別測定和比較各種中藥的MIC值。對抑菌作用明顯的中藥進行產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌MIC比較。 結果 中藥烏梅、五倍子、黃連、黃芩、黃柏、穿心蓮、魚腥草、重樓、金銀花、連翹對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的MIC值分別為（17.19±4.94）mg/mL、（18.75±6.59）mg/mL、（37.50±10.21）mg/mL、（46.20±15.10）mg/mL、（450±105.41）mg/mL、（475±79.06）mg/mL、（237.50±39.53）mg/mL、（118.75±59.29）mg/mL、（425±88.19）mg/mL、（225±52.70）mg/mL，其中烏梅、五倍子、黃連、黃芩的MIC均值分別為17.19 mg/mL、18.75 mg/mL、37.50 mg/mL、46.20 mg/mL，有較好的抑菌效果。烏梅、五倍子、黃連、黃芩對產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌MIC值經(jīng)統(tǒng)計學處理，P > 0.05。 結論 10味中藥對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌株均有不同程度的體外抑菌活性。其中烏梅和五倍子效果最強，其次是黃連、黃芩，其余的中藥抑菌活性較弱。

[關鍵詞] 中藥；大腸埃希菌；超廣譜β-內酰胺酶；藥物敏感試驗

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）31-0065-03

眾所周知，大腸埃希菌是醫(yī)院內感染常見的病原菌，隨著抗生素的廣泛使用，細菌的耐藥性問題也趨于嚴重[1]。有報道稱產(chǎn)超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）大腸埃希菌已占臨床分離到的大腸埃希菌60.1%[2]。因此，探尋新的不同于抗生素的抗菌藥物對于改善產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌感染性疾病的治療現(xiàn)狀具有重要意義。近年來許多研究表明中藥具有抑菌的生物活性[3-6]。本文旨在研究烏梅等10味中藥對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的體外抑菌活性，為臨床應用中藥治療耐藥菌感染提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌均來源于新余市中醫(yī)院門診和住院患者的臨床標本。分離培養(yǎng)按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第3版[7]進行，鑒定和藥敏使用合肥恒星細菌鑒定和藥敏分析儀。ESBLs的確證實驗采用臨床和實驗室標準化研究所（CLSI）推薦的雙紙片相鄰試驗（協(xié)同法）[8]。各收集至少10株經(jīng)過確認的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌保存-20℃冰箱中備用。

1.2 標準菌株

大腸埃希菌ATCC25922，由溫州康泰公司提供。

1.3 中藥煎液的制備

十種中藥烏梅、黃連、黃芩、黃柏、五倍子、穿心蓮、重樓、金銀花、魚腥草、連翹均取自新余市中醫(yī)院中藥房。以烏梅為例。將100 g烏梅置于燒瓶中，加入5～8倍體積的蒸餾水，浸泡30 min，加熱待其沸騰后調節(jié)火力大小使其微沸30 min，過濾將濾液倒入燒杯中。然后往燒杯中加入約3～5倍體積蒸餾水，加熱煮沸，微沸30 min，過濾。合并兩次濾液，并進行減壓蒸餾，使藥液體積達100 mL，即得到中藥的水提濃縮液，濃度為1 000 mg/mL。滅菌后儲存在-20℃冰箱中備用。

1.4 菌懸液的制備

挑取經(jīng)過活化和純培養(yǎng)18～24 h的菌落，用生理鹽水調成0.5麥氏比濁單位（含菌量1.5×108 CFU/mL），再1∶10稀釋，使其含菌量為1.5×107 CFU/mL，備用。

1.5 MIC測定

采用CLSI推薦的瓊脂稀釋法。

1.5.1 含藥平板制備 取三角燒瓶10只，分別加入融化的MH瓊脂25 mL，在第一只加入100%（1∶1）的中藥煎液25 mL，使其濃度為500 mg/mL，混勻后取出25 mL，加入第二只燒瓶中，再混勻后取出25 mL加入第三只燒瓶中，依此類推，直到最終濃度為0.98 mg/mL，高壓滅菌后傾倒平板待用。

1.5.2 瓊脂稀釋法 用上述配好的含藥MH瓊脂平板（含藥量分別為500、250、125、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95 mg/mL）進行實驗。用微量移液器吸取1 μL含菌量為1.5×107 CFU/mL的菌懸液接種平板，最終接種菌量約每個接種點為104個菌。待菌液干后將平板倒置放35℃溫箱培養(yǎng)18～24 h后觀察結果，以肉眼觀察無細菌生長的最低藥物濃度為MIC。

經(jīng)過實驗，將對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌抑菌效果較明顯的中藥篩選出來，再對這些中藥進行非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的抑菌實驗，記錄MIC值。

1.6 統(tǒng)計學處理

使用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件分析處理，數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌抑菌效果較明顯的是烏梅、五倍子、黃連、黃芩等4味中藥，具體結果見表1、表2。

從表1可以看出，在較低含量藥物水平下，依然對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌抑菌效果較明顯的中藥是烏梅、五倍子、黃連、黃芩。從表2可以看出，烏梅、五倍子、黃連、黃芩對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌MIC值在（15.63～62.50） mg/mL之間，平均MIC值分別為（17.19±4.94） mg/mL、（18.75±6.59） mg/mL、（37.50±10.21） mg/mL、（46.20±15.10） mg/mL，MIC90值分別是15.63 mg/mL、15.63 mg/mL、31.25 mg/mL、31.25 mg/mL。穿心蓮、魚腥草、黃柏、重樓、金銀花、連翹等6味中藥對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌也有一定的抑菌作用，但只有在較高濃度時才能抑制產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的生長。烏梅、五倍子、黃連、黃芩4味中藥的MIC90值遠低于穿心蓮等6味中藥的MIC90值，兩者比較有顯著性差異（t = 3.45，P < 0.05）。

烏梅、五倍子、黃連、黃芩對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和非產(chǎn)酶大腸埃希菌的MIC值經(jīng)統(tǒng)計學處理，無顯著性差異（P > 0.05），結果見表3。

3 討論

近年來，大腸埃希菌多重耐藥株的大量出現(xiàn)，使臨床對大腸埃希菌引起的感染治療越來越困難，幾乎到了無藥可用的地步。ESBLs是指質粒介導的能賦予細菌對多類β-內酰胺類抗生素耐藥的一類酶。由于質?？稍诰觊g轉移和傳播，同時該酶有較廣的水解底物譜，且部分產(chǎn)ESBLs菌株不但對β-內酰胺類抗生素耐藥，而且還對氨基糖苷類、喹諾酮類等藥物耐藥，因此給臨床抗感染治療帶來很大困難[9]。

國內外對于中藥抗大腸埃希菌的報道較多，對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌株的中藥研究較少。周雪寧等[10]對五倍子進行了體外抗產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的研究，并與清熱解毒類的黃芩、黃連進行對比。結果顯示，三種中藥單味水煎劑對20株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌均有不同程度的抑菌作用，抑菌作用經(jīng)方差檢驗有顯著性差異，以五倍子效果最好。欒耀芳等[11]對黃芩等8種中藥水煎劑采用瓊脂稀釋法，以臨床收集的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌為實驗組，同時以非產(chǎn)酶大腸埃希菌為對照組進行體外敏感性研究，觀察各藥物的最低殺菌濃度。結果顯示黃芩對產(chǎn)酶大腸埃希菌的抗菌作用最好，黃連、大青葉次之，兩組結果經(jīng)統(tǒng)計學處理，差異無統(tǒng)計學意義。

我們用烏梅等10種中藥對來自于臨床的10株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌株進行體外抗菌活性篩選，結果發(fā)現(xiàn)這10種中藥均有不同程度的抑菌活性，穿心蓮、魚腥草、黃柏、重樓、金銀花、連翹只有在較高濃度時才能抑制產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的生長，而烏梅、五倍子、黃連、黃芩在較低濃度時就有抑菌作用。尤其是烏梅和五倍子水煎劑在低濃度時對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的抑制作用最明顯，是極具開發(fā)價值的抗產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的中藥。

從烏梅、五倍子、黃連、黃芩對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和非產(chǎn)酶大腸埃希菌的MIC值的比較可以看出，兩組結果無顯著性差異（P > 0.05）。中藥對產(chǎn)酶和非產(chǎn)酶大腸埃希菌株的體外抑菌活性并無差異，說明中藥的抗菌機制與抗生素存在不同。許多中藥中不含酰胺環(huán)或成分復雜，ESBLs對其沒有水解作用；中藥中含有的一些特殊成分如五倍子中的鞣酸、黃連中的小檗堿等能抑制和干擾細菌的代謝；另外中藥調節(jié)及提高機體免疫力的功能也在抗菌機制中起了相當重要的作用[12]。除此之外，關于中藥的抑菌機制還有許多問題需要我們進一步研究探討。

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（收稿日期：2013-07-15）