補(bǔ)腎化痰祛瘀法對(duì)血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能的保護(hù)作用

[摘要] 目的 研究補(bǔ)腎化痰祛瘀方對(duì)血管性癡呆（VaD）大鼠認(rèn)知功能的改善作用。 方法 在缺糖缺氧培養(yǎng)條件下，觀察補(bǔ)腎化痰祛瘀方血清對(duì)體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用。用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法（2VO）制備VaD大鼠模型，造模前予灌胃治療，Morris水迷宮測(cè)試治療后VaD大鼠認(rèn)知功能的改善情況，TUNEL染色測(cè)定各組大鼠海馬腦組織內(nèi)細(xì)胞凋亡的變化。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。 結(jié)果 在缺糖缺氧培養(yǎng)條件下，體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元出現(xiàn)大量的細(xì)胞凋亡，而預(yù)先加入補(bǔ)腎化痰祛瘀方的血清進(jìn)行處理后，細(xì)胞凋亡率明顯下降。補(bǔ)腎化痰祛瘀方灌胃治療的VaD大鼠，與未予治療的VaD大鼠組相比，治療組大鼠找到平臺(tái)的潛伏期縮短（P < 0.01），穿越平臺(tái)次數(shù)增多（P < 0.01）；與癡呆組相比，補(bǔ)腎化痰祛瘀方治療組大鼠腦組織海馬區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加，凋亡基因Bax蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 補(bǔ)腎化痰祛瘀方對(duì)大鼠體外培養(yǎng)和腦組織內(nèi)海馬神經(jīng)元具有神經(jīng)保護(hù)作用，補(bǔ)腎化痰祛瘀方治療可以明顯改善VaD大鼠的認(rèn)知功能。

[關(guān)鍵詞] 補(bǔ)腎化痰祛瘀方；血管性癡呆；認(rèn)知功能；細(xì)胞凋亡

[中圖分類號(hào)] R277.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）31-0001-03

血管性癡呆（vascular dementia，VaD）是由一系列腦血

[基金項(xiàng)目] 廣東省廣州市中醫(yī)藥、中西醫(yī)結(jié)合科研課題（2009A25）；廣東省中醫(yī)藥局科研立項(xiàng)（2010020）；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金立項(xiàng)（A201 3506）；廣東省廣州市衛(wèi)生局一般引導(dǎo)項(xiàng)目（20131A011047）

血管性癡呆（vascular dementia，VaD）是由一系列腦血管因素（缺血或出血或急慢性缺氧性腦血管病等）導(dǎo)致腦組織損害，引起以認(rèn)知功能障礙為特征的綜合征[1，2]。血管性癡呆屬于中醫(yī)學(xué)“呆病”范疇，其病位在腦，其本在于心肝脾腎的功能失調(diào)；其標(biāo)在于痰濁癖血，蒙閉清竅，致神機(jī)失用。補(bǔ)腎化痰祛瘀方具有補(bǔ)腎填精，益髓充腦，使腦髓得充，氣血得益，兼化癖濁，開腦竅的作用[3，4]。本研究采用補(bǔ)腎化痰祛瘀方腦內(nèi)注射治療VaD模型大鼠，觀察其對(duì)VaD大鼠認(rèn)知功能的改善作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 出生后第1天SD大鼠4只；老齡健康雄性SD大鼠65只，月齡>16個(gè)月，體重300～450 g，由中山大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 藥物 補(bǔ)腎化痰祛瘀方為熟地、山茱萸、枸杞子、制首烏、菟絲子、桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎、丹參、制半夏、炙遠(yuǎn)志、石菖蒲、膽南星、枳實(shí)等組成，經(jīng)水煎制成濃縮液，高、低劑量組分別相當(dāng)于含生藥2 g/mL和1 g/mL。

1.1.3 試劑 Neurobasal A（Gibco），B27（Gibco），胎牛血清（Sigma），胰蛋白酶（Gibco），多聚賴氨酸（Sigma），阿糖胞苷（上海華聯(lián)制藥有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 補(bǔ)腎化痰祛瘀方對(duì)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用 （1）海馬神經(jīng)元的培養(yǎng) 取出生1 d的SD大鼠，在無(wú)菌條件下分離出雙側(cè)海馬，充分剪碎，加入0.125%胰蛋白酶，在37℃水浴中溫育30 min，10%胎牛血清終止消化，小心地吸除胰蛋白酶液，加入5 mL PBS，輕柔地震動(dòng)混勻，靜置5 min；吸除上清，加入5 mL PBS，用吸管吹打分散組織制成細(xì)胞懸液，用臺(tái)盼蘭染色以了解細(xì)胞活性；按1 000/cm2的密度接種于有多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的Neurobasal A+B27的培養(yǎng)基5 mL，于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后用Neurobasal A+B27無(wú)血清培養(yǎng)基全量換液，以后每周換液2次，每次更換一半新鮮培養(yǎng)液。在神經(jīng)元接種3 d后加入終濃度為3 mg/L的阿糖胞苷，以抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖[5]。（2）補(bǔ)腎化痰祛瘀方藥物血清和空白血清的收集 SD大鼠灌胃給予補(bǔ)腎化痰祛瘀方的濃縮液，相當(dāng)于生藥量為25 g/kg，2次/d，給藥7 d，末次給藥2 h后，無(wú)菌條件下，心室內(nèi)取血，分離血清，56℃補(bǔ)體滅活，-80℃凍存?zhèn)溆?。用于?shí)驗(yàn)時(shí)，用完全培養(yǎng)基分別稀釋成5%、10%、20%三種不同濃度的含藥血清?？瞻籽宓墨@得是予SD大鼠灌服0.9%生理鹽水連續(xù)7 d，給藥時(shí)間、方法和獲取血清方法同補(bǔ)腎化痰祛瘀方。（3）缺氧缺糖試驗(yàn) 取培養(yǎng)12 d的海馬神經(jīng)元，按實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、空白血清組和補(bǔ)腎化痰祛瘀方組，在缺糖缺氧前24 h，按如下方案給藥：①培養(yǎng)基組，②空白血清組，③5%含藥血清組，④10%含藥血清組，⑤20%含藥血清組，更換無(wú)糖平衡鹽緩沖液（116 mmol/L NaCl，5.4 mmol/L KCl，0.8 mmol/L MgSO4，1.1 mmol/L NaH2PO4，26.2 mmol/L NaHCO3， 1.8 mmol/L CaCl2）。然后將各組細(xì)胞同時(shí)移至恒溫（37℃）密閉容器內(nèi)，連續(xù)充以無(wú)氧氣體（90%N2、10%CO2），在缺糖缺氧條件下分別培養(yǎng)1 h、4 h、12 h后，進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。（4）細(xì)胞凋亡分析 將上述在缺糖缺氧環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞，先經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min后，然后采用甩片法將細(xì)胞貼壁在玻片上，加入TUNEL反應(yīng)試劑，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)相鄰視野TUNEL陽(yáng)性染色及陰性染色神經(jīng)元數(shù)目，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.2 血管性癡呆大鼠模型的建立及分組處理 將雄性SD大鼠用10%水合氯醛（0.035 mL/10 g）腹腔注射麻醉后，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，并以4號(hào)絲線阻斷血流20 min，可以觀察到大鼠驚厥、呼吸深慢、心跳加快；同時(shí)在距鼠尾尖約1 cm處斷尾，放血約0.3 mL。松開絲線扣恢復(fù)血流10 min后，再次阻斷血流20 min，如此重復(fù)3次，第3次血流再灌注后觀察30 min，如大鼠呼吸、心跳平穩(wěn)，即可縫合皮膚，放回籠中正常飼養(yǎng)。其中假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，套絲扣；但不阻斷血流，尾部不放血，觀察時(shí)間、飼養(yǎng)條件與模型組相同。造模前大鼠隨機(jī)分成6組，每組10只：正常組，假手術(shù)組，模型組，尼莫地平組，補(bǔ)腎化痰祛瘀方低劑量組，補(bǔ)腎化痰祛瘀方高劑量組。補(bǔ)腎化痰祛瘀方低、高劑量組分別給大鼠灌胃該藥水煎液，相當(dāng)于生藥量10.0 g/（kg·d）和20.0 g/（kg·d），正常組、假手術(shù)組、模型組均給予等容積的生理鹽水灌胃；而尼莫地平組灌胃用尼莫地平混懸液10 mg/（kg·d），手術(shù)當(dāng)天提前2 h灌胃，直至術(shù)后15 d。在灌胃后30 d，分別對(duì)上述各組大鼠進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)，觀察各組大鼠學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)。

1.2.3 Morris水迷宮測(cè)試 （1）定位航行試驗(yàn) 水溫控制在25℃左右，每日上下午各4次，將大鼠面向池壁分四個(gè)象限放入水中，記錄其在2 min內(nèi)尋找到平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期）。如果大鼠在2 min內(nèi)未找到平臺(tái)，則用手牽引其至平臺(tái)上，讓大鼠停留20 s，再放回籠中，其潛伏期算120 s。歷時(shí)5 d。（2）空間探索試驗(yàn) 第6天撤除平臺(tái)，將大鼠任選1個(gè)入水點(diǎn)放入，記錄其2 min內(nèi)跨越原平臺(tái)位置的次數(shù)。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)Bcl-2、Bax陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá) 各組大鼠在行為測(cè)試完畢后以10%水合氯醛麻醉，立即開胸暴露心臟，左心室迅速插管至主動(dòng)脈，同時(shí)剪開右心耳，灌注生理鹽水100 mL，再灌注4%的多聚甲醛250 mL，速度先快后慢，至頸部非常僵硬為滿意，迅速取腦并分離左側(cè)海馬區(qū)組織，4%多聚甲醛中浸置4～6 h，經(jīng)乙醇常規(guī)脫水、二甲苯透明后，浸蠟包埋，5 μm厚切片，行免疫組化染色，嚴(yán)格按照說(shuō)明操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，方差齊性檢驗(yàn)以a=0.1為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。組間比較應(yīng)用單因素方差分析，各實(shí)驗(yàn)組間的兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

TUNEL陽(yáng)性染色光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞胞核呈棕黃色，缺氧缺糖后，隨著缺氧缺糖時(shí)間的延長(zhǎng)凋亡細(xì)胞逐漸增多。凋亡的神經(jīng)元表面皺縮，體積縮小，細(xì)胞核固縮，有時(shí)可見碎裂成數(shù)個(gè)圓形顆粒的凋亡小體。培養(yǎng)基組和空白血清組之間無(wú)明顯差異（P > 0.05）。經(jīng)補(bǔ)腎化痰祛瘀方預(yù)處理的海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少，凋亡神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生率與培養(yǎng)基組、空白血清組比均有顯著性差異（P < 0.05），且與含藥血清濃度具有相關(guān)性。在三種不同濃度的含藥血清組間，20%含藥血清細(xì)胞凋亡率最低。見表1。

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

模型組所用逃避潛伏期時(shí)間明顯長(zhǎng)于空白組、尼莫地平組、補(bǔ)腎化痰祛瘀方高劑量組及低劑量組，均有顯著差異（P < 0.01）。補(bǔ)腎化痰祛瘀方高劑量組逃避潛伏期時(shí)間較尼莫地平組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？臻g探索試驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)腎化痰祛瘀方高劑量組、低劑量組、尼莫地平組跨越平臺(tái)次數(shù)均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。補(bǔ)腎化痰祛瘀方高劑量組逃避潛伏期時(shí)間、跨越平臺(tái)次數(shù)高于尼莫地平組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)Bax，Bcl-2蛋白的表達(dá)

與假手術(shù)組比較，模型組凋亡基因Bax蛋白表達(dá)顯著增加（P < 0.01），抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降（P < 0.01）。與模型組比較，尼莫地平組、補(bǔ)腎化痰祛瘀方低劑量組、補(bǔ)腎化痰祛瘀方高劑量組抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加（P < 0.01），凋亡基因Bax蛋白表達(dá)降低（P < 0.01）。說(shuō)明補(bǔ)腎化痰祛瘀方可能通過(guò)影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。補(bǔ)腎化痰祛瘀方高劑量組與尼莫地平組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)增加，Bax蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表3。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，血管性癡呆是在精氣虧虛的前提下產(chǎn)生瘀血、痰濁后形成的本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜證，補(bǔ)腎化痰祛瘀法補(bǔ)腎填精治其本，化痰祛瘀治其標(biāo)，標(biāo)本兼顧，故對(duì)血管性癡呆有防治作用。補(bǔ)腎化痰祛瘀方是在醒腦益智方和加味溫膽湯的基礎(chǔ)上化裁而來(lái)，方中的枸杞子具有增強(qiáng)造血功能、降脂、調(diào)節(jié)免疫、延緩衰老等作用，制首烏、菟絲子可增加腦組織SOD活性，山萸肉滋補(bǔ)肝腎，桃仁、紅花、當(dāng)歸活血祛瘀，菖蒲化痰開竅，共奏補(bǔ)腎固本、化痰祛瘀開竅之功。全方配伍，具有補(bǔ)腎填精，益髓充腦，使腦髓得充，氣血得益，兼化癖濁，開腦竅的作用，從而達(dá)到治療VaD的目的。在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用補(bǔ)腎化痰祛瘀方對(duì)血管性癡呆大鼠進(jìn)行治療，可明顯改善大鼠搜索平臺(tái)的潛伏期和跨越平臺(tái)的次數(shù)，改善大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。

短暫性腦缺血或缺血后再灌注后引起的海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡（DND），是VaD常見的發(fā)生機(jī)制之一，CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡損傷可能是腦血管病后發(fā)生VaD的病理基礎(chǔ)，海馬神經(jīng)元的凋亡丟失和缺血壞死影響了神經(jīng)元突觸的可塑性，影響了海馬對(duì)信息的處理和傳遞，引起腦缺血后記憶認(rèn)知功能損害[6-9]。近年研究表明，中藥不僅可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，提高神經(jīng)元抵抗損傷的能力，并對(duì)CNS神經(jīng)再生及神經(jīng)功能重建具有促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)中，在缺糖缺氧培養(yǎng)條件下體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元出現(xiàn)大量的細(xì)胞凋亡，而預(yù)先加入補(bǔ)腎化痰祛瘀方血清進(jìn)行處理后，細(xì)胞凋亡率明顯下降，說(shuō)明補(bǔ)腎化痰祛瘀方對(duì)缺糖缺氧培養(yǎng)條件誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡有拮抗作用，因此具有神經(jīng)保護(hù)作用，提高抵抗神經(jīng)元損傷能力。

近來(lái)的體外研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示：Bcl-2保護(hù)細(xì)胞免于各種損傷，包括興奮性氨基酸毒性、Ca增多、脂質(zhì)過(guò)氧化、自由基損傷等。Bcl-2表達(dá)的增加對(duì)腦缺血后損傷具有保護(hù)作用。Bax蛋白是促進(jìn)細(xì)胞凋亡因子。促凋亡Bax蛋白在局灶和全腦缺血中對(duì)注定死亡的神經(jīng)元出現(xiàn)表達(dá)增多的現(xiàn)象，而在缺血損傷后恢復(fù)的神經(jīng)元中的表達(dá)穩(wěn)定。在我們的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，VaD模型組大鼠CA1區(qū)Bax高表達(dá)，Bcl-2低表達(dá)，凋亡細(xì)胞增多，證實(shí)了長(zhǎng)期低灌注可使海馬神經(jīng)元凋亡，影響認(rèn)知和記憶。補(bǔ)腎化痰祛瘀方低劑量組和高劑量組與模型組相比，均有Bcl-2的高表達(dá)、Bax的低表達(dá)，凋亡細(xì)胞也明顯減少。說(shuō)明補(bǔ)腎化痰祛瘀方能抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元、改善VaD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的效果，其機(jī)制與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)相關(guān)。

總之，補(bǔ)腎化痰祛瘀方在拮抗VaD大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，與其在行為學(xué)上改善VaD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力一致。由此我們可以推斷補(bǔ)腎化痰祛瘀方可以通過(guò)促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，減少Bax的表達(dá)，抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，從而改善VaD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，兩者是相輔相成，互為因果。下一步的實(shí)驗(yàn)中我們將進(jìn)一步研究補(bǔ)腎化痰祛瘀方保護(hù)神經(jīng)元的分子機(jī)制。

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（收稿日期：2013-08-29）