水稻紋枯病菌毒素提取及其對(duì)水稻的毒性

李 路，王 玲，劉連盟，侯恩慶，肖丹鳳，黃世文

(1.廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣西南寧 530003;2.中國(guó)水稻研究所，浙江杭州 310006)

水稻紋枯病是遍及全球的水稻病害。目前該病已在亞、非、歐、美各洲水稻種植國(guó)家普遍發(fā)生，一般減產(chǎn)10%～30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50%，對(duì)水稻生產(chǎn)威脅很大。隨著高產(chǎn)、矮稈、多蘗良種的推廣以及種植密度和施氮量的增加，其危害日趨嚴(yán)重，造成很大的損失［1］。該病害由水稻紋枯病菌引起，紋枯病菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生毒素。研究表明，水稻紋枯病菌粗毒素對(duì)水稻有明顯毒害作用，不僅能引起紋枯病的相似病斑，而且抑制胚根生長(zhǎng)，致使幼苗萎蔫［2］，這顯示毒素在病菌致病過(guò)程中起非常重要的作用。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)水稻紋枯病的防治主要依賴(lài)于化學(xué)藥劑和栽培措施，但防治效果不甚理想［3］。選用抗病品種是防治水稻紋枯病發(fā)生為害的有效途徑，也是綜合防治的關(guān)鍵措施［2］。但之前有關(guān)紋枯病抗性鑒定的方法如苗期、成株期鑒定，溫室、大田接種等存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)工、出結(jié)果慢的缺點(diǎn)，且關(guān)于該病抗性品種的快速鑒定方法在國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道［4］。通過(guò)探究不同致病力的毒素對(duì)不同抗性的水稻種子發(fā)芽率、胚根及胚芽生長(zhǎng)的影響，旨在探索水稻紋枯病簡(jiǎn)便、快速、有效的鑒定方法。本試驗(yàn)為水稻抗紋枯病初篩毒素處理進(jìn)行探索，故利用的材料是已知不同抗性的品種。

現(xiàn)將有關(guān)試驗(yàn)結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻品種 (類(lèi)型):中浙優(yōu)1號(hào) (雜交稻，較感紋枯病)、秀水09(粳稻，較感紋枯病)、ZH5(秈稻，較抗紋枯病)。

供試菌株:水稻紋枯病菌 GD-118(強(qiáng)致病力)、YN-7(中等致病力)、YN-3(弱致病力)。

以上材料均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 粗毒素制備

將3個(gè)菌種接種到PDA培養(yǎng)基上，27℃下培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)平板。產(chǎn)毒培養(yǎng)基為改良的Richard培養(yǎng)基:KNO310 g，KH2PO45 g，MgSO4·7H2O 2.5 g，F(xiàn)e2(SO4)30.02 g，蔗糖 50 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6～7。從平板菌落邊緣取直徑為5 mm的5塊菌絲塊至50 mL改良Richard培養(yǎng)基中，27℃下黑暗培養(yǎng)15 d，每天人工振蕩2次。

粗毒素提取參照徐敬友等［4］方法:將培養(yǎng)濾液加熱，產(chǎn)生白色沉淀后再用濾紙過(guò)濾。在濾液中加入30 g活性炭，4℃條件下靜置吸附12 h，再以8 500 r·min-1離心15 min。然后，將活性炭沉淀用等體積甲醇洗脫，再將洗脫液于60℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，獲得黃色漿狀物即為水稻紋枯病菌粗毒素。

1.3 粗毒素生物活性測(cè)定

1.3.1 粗毒素對(duì)水稻種子發(fā)芽的影響

將3個(gè)菌種粗毒素分別稀釋10，50和100倍。取10 mL毒素稀釋液置鋪有1層濾紙 (直徑10 cm)的培養(yǎng)皿中，重復(fù)3次，以蒸餾水為對(duì)照。選擇健康飽滿(mǎn)的上述粳稻、秈稻和雜交稻種子，先將水稻種子用清水預(yù)浸2 h，撈起瀝干水后，浸入3%H2O2中消毒24 h后撈起，用蒸餾水沖洗干凈，然后置于不同毒素稀釋液的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿30粒。在25℃下催芽72 h，記錄種子的根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)，計(jì)算發(fā)芽率。根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)均超過(guò)0.50 cm(含0.50 cm)記為發(fā)芽。計(jì)算公式如下:

發(fā)芽抑制率/%=100×(對(duì)照種子發(fā)芽率 -處理種子發(fā)芽率)/對(duì)照種子發(fā)芽率。

1.3.2 粗毒素對(duì)胚根和胚芽生長(zhǎng)的影響

用3%H2O2對(duì)3種水稻種子消毒24 h，無(wú)菌水沖洗，30℃下清水浸種催芽48 h。將種子置于鋪有濾紙的含10 mL毒素稀釋液的培養(yǎng)皿中，每皿15粒種子，30℃下黑暗培養(yǎng)48 h，重復(fù)3次，以蒸餾水為對(duì)照，測(cè)定胚根和胚芽長(zhǎng)度。計(jì)算公式如下:

胚根 (芽)伸長(zhǎng)抑制率/%=100× (對(duì)照胚根或胚芽平均長(zhǎng)度-處理胚根或胚芽平均長(zhǎng)度)/對(duì)照胚根或胚芽平均長(zhǎng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗毒素對(duì)水稻種子發(fā)芽的影響

3個(gè)菌種的毒素粗提物均對(duì)水稻種子發(fā)芽有不同程度的抑制作用，并且抑制率隨著毒素濃度的提高而增大。不同菌株產(chǎn)生的毒素毒性不相同，毒素毒性強(qiáng)弱依次為GD-118＞YN-7＞YN-3。GD-118的毒素稀釋10倍后能完全抑制中浙優(yōu)1號(hào)和秀水09的種子發(fā)芽。同種毒素相同濃度下，不同類(lèi)型的水稻種子表現(xiàn)出不同的抗性，抗性從強(qiáng)到弱依次為ZH5＞秀水09＞中浙優(yōu)1號(hào)。YN-3毒素稀釋100倍時(shí)，ZH5的種子全部能發(fā)芽 (表1)。

表1 3種紋枯病菌粗毒素對(duì)不同類(lèi)型水稻種子發(fā)芽的影響

2.2 粗毒素對(duì)胚根、胚芽生長(zhǎng)的影響

催芽后的種子浸入毒素稀釋液后，胚芽和胚根的伸長(zhǎng)受到了不同程度的抑制。由表2可知，YN-3毒素的毒性相對(duì)最弱，毒性最強(qiáng)的GD-118毒素稀釋10倍后完全抑制了中浙優(yōu)1號(hào)和秀水09胚根的生長(zhǎng)。且毒素對(duì)于胚根的抑制程度大于對(duì)胚芽的抑制。與發(fā)芽率結(jié)果相似，ZH5胚根和胚芽的生長(zhǎng)對(duì)紋枯病菌毒素表現(xiàn)出了較好的耐受性。

表2 3種紋枯病菌粗毒素對(duì)不同類(lèi)型水稻胚根、胚芽生長(zhǎng)的影響

3 小結(jié)和討論

試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同抗性類(lèi)型的水稻品種種子的發(fā)芽率、胚根、胚芽生長(zhǎng)對(duì)相同菌株相同濃度的粗毒素的敏感性反應(yīng)是不同的。抗性強(qiáng)的品種，對(duì)毒素毒性的耐受性就越高，反之亦然。不同致病力的紋枯病菌菌株產(chǎn)生的粗毒素其毒性是不同的，致病力越強(qiáng)，產(chǎn)生的毒素毒性越高。

本實(shí)驗(yàn)僅提取了粗毒素用于試驗(yàn)，未對(duì)離體葉片的影響進(jìn)行研究。黃文文等［3］將粗毒素接種在4葉期水稻離體葉片上，3 d后發(fā)現(xiàn)葉片上產(chǎn)生病斑，也驗(yàn)證了毒素的致病性。另外，本研究的供試品種較少，今后需進(jìn)一步研究更多水稻品種對(duì)毒素的敏感性和抗感標(biāo)準(zhǔn)，使毒素在紋枯病抗性鑒定中得到更好地應(yīng)用。對(duì)于紋枯病毒素的成分，很多報(bào)道的看法不一［3—7］。劉洪濤等［6］認(rèn)為采用培養(yǎng)產(chǎn)物的毒素混合物比用提純的單一毒素會(huì)更接近病菌在寄主上分泌毒素的組分狀態(tài)。菌株毒素與品種抗性互作是可以鑒別出水稻品種對(duì)紋枯病的抗性的，用紋枯病菌產(chǎn)生的毒素來(lái)進(jìn)行水稻品種或資源的抗紋枯病鑒定是可行的，結(jié)果與其他接種鑒定基本一致。

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