水果中阿斯巴甜的研究

金建秀 ，劉東華，石 杰，杜 平

新疆中基天然植物純化高新技術(shù)研究院有限公司，烏魯木齊830088

阿斯巴甜(Aspartame，APM，C14H18N2O5)，學(xué)名是天門冬酰苯丙氨酸甲酯，俗稱甜味素。最早由美國G.D.Searle 公司的研究人員在合成促胃液分泌激素時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)其甜味，成為二肽類中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)有甜味的物質(zhì)。由于其甜度高、熱量低、無不良后味和易與酸味食品調(diào)和等特點(diǎn)被廣泛用作食品、飲料的甜味劑。自1981 年美國食品和藥品管理局核準(zhǔn)通過使用后，該甜味劑已經(jīng)在超過100 個(gè)國家使用。

目前對(duì)阿斯巴甜的研究集中在合成［1］、應(yīng)用［2］、安全性［3，4］及含量檢測(cè)［5-8］方面，對(duì)于天然植物中是否存在阿斯巴甜，在合成阿斯巴甜方法中必須的前體分子苯丙氨酸(Phe)、天冬氨酸(Asp)［9-11］和甲醇在水果中是否存在，與阿斯巴甜的對(duì)應(yīng)關(guān)系尚未見報(bào)道。本文根據(jù)HPLC-QQQ-MS/MS 具有定性、定量及篩選能力強(qiáng)的特點(diǎn)，用HPLC-QQQ-MS/MS 分別對(duì)獼猴桃等8 種水果中的苯丙氨酸、天冬氨酸和阿斯巴甜進(jìn)行測(cè)定，用HS-GC 分別對(duì)8 種水果中的甲醇進(jìn)行測(cè)定。并進(jìn)行模擬合成實(shí)驗(yàn)，通過對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，從化學(xué)角度對(duì)阿斯巴甜在水果中是否存在進(jìn)行探討。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent RRLC1200 高效液相色譜儀，Triple Quad LC/MS 6410 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，Agilent6890N GC 氣相色譜儀配有7694E 頂空進(jìn)樣器、FID 檢測(cè)器(美國安捷倫科技公司);BS210S 電子天平(賽多利斯);勻漿機(jī)HR1617(飛利浦);離心機(jī)GT10-1(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司);PHS-3B酸度計(jì)(上海雷磁)。

甲醇、甲酸、甲酸銨均為色譜純，購于美國TEDIA 公司;天冬氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜均＞99%，購于德國Dr.Ehrenstorfer 公司;丹酰氯＞95%，購于美國Sigma 公司;碳酸鉀、乙酸、乙酸銨、乙腈均為分析純，購于天津市福晨化學(xué)試劑廠;橙、獼猴桃、桔、菠蘿、芒果、蘋果、香梨、香蕉均購自市場(chǎng)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

苯丙氨酸和天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取苯丙氨酸和天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg 分別于2 個(gè)100 mL 容量瓶中，加入2 mL 水及5 滴10%碳酸鉀溶液溶解，定容至刻度，制成100 mg/L 的苯丙氨酸和天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別移取兩種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5.0 mL 于2 個(gè)100 mL 容量瓶中，定容至刻度，得到5.0 mg/L 的苯丙氨酸和天冬氨酸工作液。

阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg 于100 mL 容量瓶中，用pH = 4.5 的緩沖溶液(乙酸-乙酸銨)定容至刻度，得到100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將此標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用緩沖溶液逐級(jí)稀釋成0.5、5.0、10.0、50.0 μg/L 的工作液。

丹酰氯標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取丹酰氯標(biāo)準(zhǔn)品50.0 mg 于100 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，制得500 mg/L 的工作液。

甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取甲醇100 mg 于100 mL 容量瓶中，定容至刻度，得到1.0 g/L 的甲醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。移取此儲(chǔ)備液2.0 mL 于10 mL 容量瓶中，定容至刻度，得到200 mg/L 的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品制備

1.3.1 測(cè)定水果中pH 值的樣品制備

將水果去皮切碎，與水按質(zhì)量比1∶2 的比例進(jìn)行勻漿，取勻漿后樣品適量，于9000 rpm 轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上清液，用pH 計(jì)測(cè)定其pH 值。

1.3.2 測(cè)定水果中甲醇含量的樣品制備

取1.3.1 中制備的勻漿樣品兩份，每份8.0 g，分別至2 個(gè)20 mL 頂空瓶中，一份加1.0 g/L 甲醇溶液2.0 mL，得到甲醇濃度為200 mg/L 的加標(biāo)樣品;另一份加蒸餾水2. 0 mL，得到空白樣品。用GC-HS 分析。

1.3.3 測(cè)定水果中阿斯巴甜含量的樣品制備

取1.3.1 中制備的勻漿樣品15 mL，加入20%乙腈溶液15 mL，混勻，于9000 rpm 轉(zhuǎn)速下離心5 min 后，移取樣品上清液于2 個(gè)10 mL 容量瓶中，每份5.0 mL，一份加50.0 μg/L 阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)液2.0 mL，用緩沖液定容至刻度，得到濃度為10.0 μg/L的加標(biāo)樣品;另一份用緩沖液定容至刻度，作為空白樣品。用HPLC-QQQ-MS/MS 分析。

1.3.4 測(cè)定天冬氨酸和苯丙氨酸含量的樣品制備

1.3.4.1 測(cè)定2種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)液中衍生物含量的樣品制備

分別移取5.0 mg/L 的天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 mL 和5.0 mg/L 苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL 于2 個(gè)試管中，并在苯丙氨酸溶液的試管中加4.0 mL 水，再分別向兩支試管中加500 mg/L 的丹酰氯標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，滴加10%碳酸鉀溶液，使試液pH 為9.5左右，最后各加乙腈5 mL，于35 ℃水浴中暗反應(yīng)1 h。將反應(yīng)液分別移至2 個(gè)100 mL 容量瓶中，用20%乙腈定容至刻度，得到0.25 mg/L 的天冬氨酸衍生物溶液和0.05 mg/L 的苯丙氨酸衍生物溶液。移取上述兩種氨基酸衍生物溶液各1.0 mL 于1 個(gè)10 mL 容量瓶中，用20%乙腈定容至刻度，得到濃度為25.0 μg/L 的天冬氨酸衍生物和5.0 μg/L 的苯丙氨酸衍生物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。用HPLC-QQQ-MS/MS 分析。

1.3.4.2 測(cè)定水果中2 種氨基酸衍生物含量的樣品制備

移取1.3.3 制備的樣品上清液0.5 mL，定容至10 mL(試液I)。分別移取試液I 0.2 mL 至2 個(gè)試管中，一份加0.25 mg/L 的天冬氨酸衍生物溶液和0.05 mg/L 的苯丙氨酸衍生物溶液各1.0 mL，另一份加2 mL 水。分別向兩支試管中滴加10%碳酸鉀溶液，調(diào)試液pH 至9.5 左右，再各加500 mg/L 的丹酰氯標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 mL，最后各加乙腈1 mL，于35℃水浴中暗反應(yīng)1 h。將反應(yīng)液分別移至2 個(gè)10 mL 容量瓶中，定容至刻度。得到一份濃度為25.0 μg/L 的天冬氨酸衍生物和5.0 μg/L 的苯丙氨酸衍生物混合樣品溶液，另一份為空白樣品溶液。用HPLC-QQQ-MS/MS 分析。

1.3.5 測(cè)定模擬合成反應(yīng)中阿斯巴甜含量的樣品制備

移取5.0 mg/L 的天冬氨酸及苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各5 mL 于一個(gè)試管中，加入2 mL 甲醇和0.2 mL乙酸，再加約3 mL 水，在50 ℃水浴下反應(yīng)8 h。用HPLC-QQQ-MS/MS 分析。

1.4 液相-質(zhì)譜條件

1.4.1 測(cè)定氨基酸衍生物的液相條件

Agilent Eclipse XDB-C18 色譜柱(50 mm × 2.1 mm，1.8 μm)。流動(dòng)相:A 為含0.1%甲酸的水溶液;B 為甲醇。梯度洗脫程序:0～1.0 min，35%B;1.0～3.0 min，35%B～90%B;3.0～ 8. 0 min，90%B;8.0～8.1min，90%～35%B。流速:0.2 mL/min。柱溫:40 ℃。進(jìn)樣量:5 μL。

1.4.2 測(cè)定阿斯巴甜的液相條件

色譜柱、流速、柱溫、進(jìn)樣量與1.4.1 相同。流動(dòng)相:0.1%甲酸水溶液-甲醇(82:18，V/V)。

1.4.3 質(zhì)譜條件

離子源:ESI+模式;監(jiān)測(cè)模式:MRM;電噴霧電壓:4000 V;霧化氣壓力:2.76 ×105Pa;反吹氣溫度:350 ℃，其它質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 天冬氨酸衍生物、苯丙氨酸衍生物及阿斯巴甜的母離子、子離子、碎裂電壓和碰撞能量Table 1 Parent ion，product ion，fragmentor and collision energy of MS for aspartic acid derivative，phenylalanine derivative and aspartame

圖1 5.0 μg/L 阿斯巴甜(APM)標(biāo)準(zhǔn)溶液與8 種水果空白樣品中阿斯巴甜的MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of aspartame in aspartame standard solution (5.0 μg/L)and eight kinds of fruit samples

1.5 氣相色譜-頂空進(jìn)樣條件

1.5.1 氣相色譜條件

DB-WAX 色譜柱(30 m × 0. 32 mm × 0. 25 μm);柱流量:1.5 m/min;分流比:5∶1;進(jìn)樣口溫度:200 ℃;柱溫:60 ℃;FID 檢測(cè)器溫度:250 ℃。

1.5.2 頂空進(jìn)樣器條件

樣品平衡時(shí)間:20 min;樣品平衡溫度:60 ℃;定量環(huán)溫度:80 ℃;加壓時(shí)間:0.2 min;定量環(huán)平衡時(shí)間:0.05 min;進(jìn)樣時(shí)間:1.0 min;定量環(huán)充樣時(shí)間:0.2 min;傳輸線溫度:90 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-QQQ-MS/MS 條件的優(yōu)化

在阿斯巴甜的檢測(cè)中，甲酸濃度顯著影響阿斯巴甜的保留時(shí)間，濃度增高保留時(shí)間延長(zhǎng);添加甲酸銨則會(huì)明顯抑制阿斯巴甜的離子化。此外，多種樣品基質(zhì)會(huì)產(chǎn)生m/z 120 的干擾峰，通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，能使目標(biāo)峰與干擾峰完全分離。經(jīng)過優(yōu)化，選擇1.4.2 條件，能兼顧運(yùn)行時(shí)間和分離度的要求(見圖1)。

對(duì)樣品中天冬氨酸和苯丙氨酸的測(cè)定是通過將其衍生化反應(yīng)后測(cè)定其衍生物來實(shí)現(xiàn)的。兩種氨基酸衍生物在色譜柱上的保留差別很大，天冬氨酸衍生物保留較弱，苯丙氨酸衍生物保留很強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)流動(dòng)相中甲酸和甲酸銨的含量對(duì)其分析影響不大。選擇1.4.1 條件，能兼顧運(yùn)行時(shí)間和分離度的要求(見圖2)。

本實(shí)驗(yàn)中，阿斯巴甜在ESI+和ESI-電離模式下均具有較強(qiáng)的質(zhì)譜信號(hào)，其ESI+模式質(zhì)譜信號(hào)略強(qiáng)于ESI-模式的，天冬氨酸衍生物和苯丙氨酸衍生物在ESI+模式下具有遠(yuǎn)強(qiáng)于ESI-模式下的質(zhì)譜信號(hào)，因此均選用ESI+電離模式進(jìn)行測(cè)定。采用MRM 監(jiān)測(cè)模式，阿斯巴甜和兩種氨基酸衍生物的母離子經(jīng)碰撞后產(chǎn)生一系列子離子，通過對(duì)碎裂電壓和碰撞能量的優(yōu)化，選擇響應(yīng)最高的一組離子為定性和定量離子。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

圖2 25.0 μg/L 天冬氨酸(Asp)和5.0 μg/L 苯丙氨酸(Phe)衍生物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液與8 種水果空白樣品中天冬氨酸及苯丙氨酸衍生物的MRM 色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of aspartic acid derivative and phenylalanine derivative in mixed standard solution (25.0 μg/L for aspartic acid derivative，5.0 μg/L for phenylalanine derivative)and eight kinds of fruit blank samples

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(Matrix Effect)，即指樣品中除分析物以外的共流出組分改變了分析物的響應(yīng)值，從而影響定量分析的準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性。實(shí)驗(yàn)中用加標(biāo)樣品的峰面積與空白樣品的峰面積的差值占加標(biāo)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積的百分比來計(jì)算衡量［12］，大于100%表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，小于100%表示基質(zhì)抑制效應(yīng)。8 種水果在LC-QQQ-MS/MS 分析中天冬氨酸和苯丙氨酸衍生物及阿斯巴甜的基質(zhì)效應(yīng)影響如圖3 所示。

2.3 HS-GC 條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)主要優(yōu)化柱溫，經(jīng)比較60 ℃的柱溫較合適，能做到目標(biāo)物峰與雜峰的基線分離(見圖4)。

圖3 8 種水果在LC-QQQ-MS/MS 分析中天冬氨酸(Asp)和苯丙氨酸(Phe)衍生物及阿斯巴甜(APM)的基質(zhì)效應(yīng)Fig.3 Matrix effects of aspartic acid derivative，phenylalanine derivative and aspartame by LC-QQQ-MS/MS in the eight kinds of fruit simples

圖4 200 mg/L 甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液和8 種水果空白樣品中甲醇的GC 色譜圖Fig.4 GC chromatograms of methanol in methanol standard solution (200 mg/L)and eight kinds of fruit blank samples

2.4 定量方法的選擇

因基質(zhì)效應(yīng)的影響，定量方法采用標(biāo)準(zhǔn)加入法。在實(shí)驗(yàn)中，為提高定量結(jié)果準(zhǔn)確度，盡量使加標(biāo)溶液濃度與樣品濃度接近。天冬氨酸和苯丙氨酸衍生物及阿斯巴甜的峰面積從提取離子流圖(EIC)中獲取(可以有效消除雜質(zhì)峰的干擾，提高定量準(zhǔn)確性)，甲醇的峰面積從GC 色譜圖中獲取。計(jì)算方法如下:

Pi=Ai/(As+i-Ai)×Cs×F

Pi:樣品中組分i 的含量，mg/kg 或μg/kg;

Cs:加標(biāo)溶液的濃度mg/kg 或μg/kg;

Ai:樣品中組分i 的峰面積;

As+i:加標(biāo)樣品的峰面積;

F:稀釋因子。

2.5 樣品的測(cè)定

2.5.1 8 種水果樣品pH 值的測(cè)定

取1.3.1 中制備的樣品上清液測(cè)定pH 值，結(jié)果見表2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明8 種水果樣品提取液均呈弱酸性，而弱酸性環(huán)境對(duì)阿斯巴甜的穩(wěn)定存在是有利的。

2.5.2 8 種水果樣品中甲醇、天冬氨酸、苯丙氨酸含量的測(cè)定

分別按1.3.2、1.3.4、1.3.3 的方法制備樣品，測(cè)定水果及其加標(biāo)樣品中的甲醇、天冬氨酸、苯丙氨酸和阿斯巴甜。結(jié)果(見表3)表明，8 種水果均含有甲醇、天冬氨酸、苯丙氨酸和阿斯巴甜。

表2 8 種水果樣品的pH 值Table 2 pH values of eight kinds of fruit samples

表3 8 種水果中甲醇、天冬氨酸(Asp)、苯丙氨酸(Phe)和阿斯巴甜(APM)的含量Table 3 The contents of methanol，aspartic acid(Asp)，phenylalanine(Phe)and aspartame(APM)in eight kinds of fruit

2.5.3 模擬合成反應(yīng)產(chǎn)物中阿斯巴甜的測(cè)定

在模擬合成反應(yīng)中，用甲酸代替水果中常見的檸檬酸或蘋果酸，該體系若能產(chǎn)生一些縮合產(chǎn)物，可以預(yù)期將是比較復(fù)雜的混合物。按照1.3.5 方法模擬合成反應(yīng)實(shí)驗(yàn)后進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果(見圖5)表明，反應(yīng)液的MRM 色譜圖中存在與阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖中保留時(shí)間相同的色譜峰，再將產(chǎn)物與阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM 色譜圖進(jìn)行比較:定量離子與定性離子相同;定量與定性離子豐度比率相近，因此，可以確認(rèn)模擬合成反應(yīng)中有阿斯巴甜生成，約1.4 μg/L。模擬反應(yīng)實(shí)驗(yàn)證明，在酸性環(huán)境條件下，當(dāng)體系中具備合成阿斯巴甜的前體分子，是可以形成阿斯巴甜的。但是，果實(shí)中阿斯巴甜的濃度比實(shí)驗(yàn)反應(yīng)生成的濃度高許多，這與生物系統(tǒng)合成有機(jī)物的高效性是否相關(guān)，目前尚不清楚。

3 結(jié)論

圖5 反應(yīng)液與5.0 μg/ L 阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)溶液匹配后的MRM 色譜圖Fig.5 MRM chromatograms of aspartame in the reaction solution and aspartame standard solution (5.0 μg/L)after chromatographic peak matching

本文采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了水果中天冬氨酸、苯丙氨酸和阿斯巴甜的分析方法，采用頂空-氣相色譜技術(shù)建立了水果中甲醇的分析方法。將所建立的方法用于測(cè)定8 種水果中的目標(biāo)成分，結(jié)果顯示8 種水果中均存在阿斯巴甜、天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇，其中甲醇、天冬氨酸和苯丙氨酸的含量差異較大，而阿斯巴甜的含量差異不大，兩者缺乏對(duì)應(yīng)關(guān)系。設(shè)計(jì)阿斯巴甜的模擬合成實(shí)驗(yàn)，表明阿斯巴甜有在水果中合成的可能。

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