肖 海, 賀興波, 黃才斌, 劉 瑤△
(贛南醫(yī)學(xué)院1病理學(xué)教研室,2第一附屬醫(yī)院醫(yī)務(wù)科,3第一附屬醫(yī)院消化科,江西 贛州341000)
原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一種全球高度惡性的腫瘤,大多數(shù)肝癌患者在發(fā)現(xiàn)癥狀時已處于病程的中晚期階段,錯過了手術(shù)治療的最佳時機[1]。我們前期研究發(fā)現(xiàn):原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中檢測到泛素連接酶SIAH2(seven in absentia homolog 2)的高表達(dá)[2]。我們推測,SIAH2 可能是一個促進肝癌發(fā)生發(fā)展的癌基因。本研究利用RNA干擾技術(shù)抑制肝癌細(xì)胞中SIAH2 的表達(dá),觀察其對HepG2 細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響,為以SIAH2 為靶標(biāo)的肝癌基因治療提供實驗依據(jù)。
人肝癌細(xì)胞株HepG2 由本室保存;pGenesil-SIAH2 重組質(zhì)粒由本室前期構(gòu)建;Lipofectamine 2000購自Invitrogen;RPMI-1640 培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco;MTS 試劑盒購自Promega;Annexin V-PE/ 7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycin D,7-AAD)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物發(fā)展技術(shù)有限公司;細(xì)胞周期檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。RNA 提取液購自武漢祥云博生物工程技術(shù)有限公司,cDNA 第1 鏈合成試劑盒、藍(lán)色預(yù)染PCR Mix以及DNA markerⅡ購自天根生化科技(北京)有限公司。兔抗人SIAH2 及GAPDH 單克隆抗體購自Santa Cruz;山羊抗兔IgG-HRP 購自武漢興華基因生物科技有限公司;ECL 為Pierce 產(chǎn)品。
2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染 HepG2 細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基(含1 ×105U/L青霉素和100 mg/L 鏈霉素)中培養(yǎng),于37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng),每3d 傳代1 次。用去內(nèi)毒素質(zhì)粒純化試劑盒提取質(zhì)粒pGenesil-SIAH2 和pGenesil-1,其含量和純度測定按分子克隆所述。通過Lipofectamin 2000 轉(zhuǎn)染處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞,每1 ×106個細(xì)胞轉(zhuǎn)染4 μg 質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染pGenesil-SIAH2 細(xì)胞的HepG2 細(xì)胞命名為HepG2-SIAH2細(xì)胞;未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的HepG2 細(xì)胞為陰性對照;轉(zhuǎn)染空載體pGenesil-1 的HepG2 細(xì)胞命名為HepG2-neo 細(xì)胞;脂質(zhì)體對照組命名為HepG2-Lipo 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24 h 在倒置熒光顯微鏡觀察瞬時轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞的熒光強度。
2.2 RT-PCR 檢測SIAH2 mRNA 的表達(dá) 提取轉(zhuǎn)染后72 h HepG2-SIAH2、HepG2-neo、HepG2-Lipo 和正常HepG2 細(xì)胞總RNA,按試劑盒要求逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。SIAH2(152 bp)上游引物5’-GAT CCA CAT GAA CGC ACG-3’,下游引物5’-GAG GGA AGC CAC GTG TAA AC-3’;內(nèi)參照GAPDH(258 bp)上游引物5’-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3’,下游引物5’-AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3’。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃30 s,48 ℃30 s,72 ℃30 s,共35 個循環(huán),末次循環(huán)后72 ℃10 min反應(yīng)結(jié)束,擴增產(chǎn)物于1 % 瓊脂糖凝膠電泳觀察。
2.3 Western blotting 檢測SIAH2 蛋白的表達(dá) 按試劑盒要求提取轉(zhuǎn)染后72 h HepG2-SIAH2、HepG2-neo、HepG2-Lipo 和正常HepG2 細(xì)胞總蛋白并定量。取40 μg 總蛋白變性5 min,進行12% SDS-PAGE 電泳,按照marker 切去需要的凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。用含10% 脫脂奶粉的TBS 4 ℃封閉過夜,加入特異性SIAH2 和GAPDHⅠ抗(濃度均為1∶1 000),37 ℃孵育1 h;室溫TBST 漂洗4 次,每次15 min。Ⅱ抗(1∶2 000)37 ℃孵育1 h,室溫漂洗4 次,每次15 min。反應(yīng)信號經(jīng)化學(xué)熒光底物發(fā)光,X 線膠片曝光。
2.4 MTS 細(xì)胞增殖實驗 分別用0.25%胰蛋白酶消化并收集HepG2 細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×108cells/L,取100 μL/well 接種至96 孔板。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作同前所述。HepG2-SIAH2、HepG2-neo、HepG2-Lipo 和正常HepG2 細(xì)胞分別在轉(zhuǎn)染后12 h、24 h、48 h 和72 h 將對應(yīng)96 孔板換液并加入100 μL/well RPMI-1640 培養(yǎng)液及10 μL/well MTS。室溫、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)4 h,酶標(biāo)儀讀取A490數(shù)據(jù)。細(xì)胞生長抑制率(%)= (1 - 實驗孔A值/對照孔A 值)×100%。
2.5 細(xì)胞周期分析 分別用0.25%胰蛋白酶消化并收集轉(zhuǎn)染后48 h 的HepG2-SIAH2、HepG2-neo、HepG2-Lipo 和正常HepG2 細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×109cells/L;制備的單細(xì)胞懸液用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇固定,4 ℃保存過夜,染色前用PBS 洗去固定液;加50 μL RNase A 37 ℃水浴30 min;再加200 μL PI 染色均勻,4 ℃避光30 min;上流式細(xì)胞儀檢測,記錄激發(fā)波長為488 nm 處紅色熒光。
2.6 細(xì)胞凋亡檢測 分別用0.25%胰蛋白酶消化并收集轉(zhuǎn)染后48 h 的HepG2-SIAH2、HepG2-neo、HepG2-Lipo 和正常HepG2 細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×109cells/L;加入200 μL Binding Buffer 懸浮細(xì)胞;加入5 μL Annexin V-PE 混勻后,加入5 μL 7-AAD混勻,室溫避光反應(yīng)5 ~15 min;在1 h 之內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。
采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,組間比較用單因素方差分析,以P <0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
HepG2 細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染重組載體pGenesil-SIAH2和空載體pGenesil-1 24 h 后,均可見明顯的綠色熒光。脂質(zhì)體組和未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的HepG2 僅見到微弱的熒光,見圖1。
RT-PCR 結(jié)果顯示,HepG2-SIAH2 細(xì)胞SIAH2 mRNA 表達(dá)量(0.02 ±0.02)顯著低于正常HepG2 細(xì)胞(0.11 ±0.05)、HepG2-neo 細(xì)胞(0.13 ±0.04)和HepG2-Lipo 細(xì)胞(0. 12 ± 0. 01)(均P <0. 05)。HepG2-neo 細(xì)胞、HepG2-Lipo 細(xì)胞和正常HepG2 細(xì)胞之間,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05),見圖2。
Figure 1. Detection of transfection efficiency by fluorescence microscopy (×200).圖1 熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率
Figure 2. The expression of SIAH2 mRNA in each group after transfection. Mean ± SD. n =3. * P <0.05 vs other groups.圖2 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后SIAH2 mRNA 相對表達(dá)量
Weatern blotting 結(jié)果顯示,HepG2-SIAH2 細(xì)胞SIAH2 蛋白表達(dá)量(0.68 ± 0.01)顯著低于正常HepG2 細(xì)胞(1.09 ±0.02)、HepG2-neo 細(xì)胞(1.05 ±0.04)和HepG2-Lipo 細(xì)胞(1.04 ± 0.04)(均P <0.05)。HepG2-neo 細(xì)胞、HepG2-Lipo 細(xì)胞和正常HepG2 細(xì)胞之間,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05),見圖3。
Figure 3. The expression of SIAH2 protein in each group after transfection. Mean ± SD. n =3. * P <0.05 vs other groups.圖3 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后SIAH2 蛋白相對表達(dá)量
用MTS 比色法檢測各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后12 ~72 h的生長情況,發(fā)現(xiàn)pGenesil-SIAH2 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖速度較其它各組明顯減慢,各時點吸光度值明顯低于HepG2-neo、HepG2-Lipo 和正常HepG2 細(xì)胞(P <0.05)。HepG2-neo、HepG2-Lipo 和正常HepG2 細(xì)胞之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)。轉(zhuǎn)染pGenesil-SIAH2 24 h 細(xì)胞吸光度值開始下降,細(xì)胞增殖抑制率為36.3% ±2.3%;48 h 抑制效果最明顯,抑制率為55.2% ±4.2%;48 h 后抑制效應(yīng)減弱,增殖速度有所提高,但仍低于其它各組;72 h 細(xì)胞抑制率為51.1% ±1.2%,各時點吸光度值見表1。
流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期的變化,與HepG2 細(xì)胞[G1期(44.62 ±0.23)%,S 期(25.66± 0.16)%]、HepG2-neo 細(xì) 胞[G1期(46.87 ±0.12)%,S 期(25.71 ±0.87)%]和HepG2-Lipo 細(xì)胞[G1期(45.29 ±0.35)%,S 期(25.92 ±0.66)%]相比較,HepG2-SIAH2 細(xì)胞G1期細(xì)胞顯著增多,S 期細(xì)胞顯著減少[G1期(49.68±0.25)%,S 期(22.94 ±0.66)%],細(xì)胞明顯阻滯于G1期(P <0.05),見圖4。
表1 MTS 法檢測pGenesil-SIAH2 轉(zhuǎn)染對HepG2 細(xì)胞增殖的影響Table 1. Effects of pGenesil-SIAH2 transfection on the proliferation of HepG2 cells measured by MTS assay(Mean±SD.n=3)
Figure 4. The cell cycle of HepG2 cells measured by flow cytometry. A:HepG2;B:HepG2-neo;C:HepG2-Lipo;D:HepG2-SIAH2.Mean±SD.n=3. * P <0.05 vs other groups.圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞細(xì)胞周期的變化
Annexin V-PE/7-AAD 流式細(xì)胞術(shù)可將實驗樣本中的正常、早期凋亡、晚期凋亡和壞死細(xì)胞區(qū)分開來,即左下象限(LL)為活細(xì)胞(Annexin V-/7-AAD-),右下象限(LR)為早期凋亡細(xì)胞(Annexin V+/7-AAD-),右上象限(UR)為晚期凋亡和壞死細(xì)胞(Annexin V+/7-AAD+)。流式結(jié)果顯示,與HepG2、HepG2-neo 和HepG2-Lipo 組相比,HepG2-SIAH2 組早期凋亡率明顯增高,差異顯著(P <0.05)。HepG2、HepG2-neo 和HepG2-Lipo 組之間,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05),見圖5。
泛素化修飾是近幾年在細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種與磷酸化作用相似的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式,與細(xì)胞生命活動、神經(jīng)系統(tǒng)退行性變、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)均有著密切的關(guān)系,特別在精細(xì)調(diào)控細(xì)胞周期,抑制或促進細(xì)胞凋亡以及激活轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)等方面發(fā)揮了重要作用,是蛋白質(zhì)發(fā)揮功能的重要調(diào)節(jié)機制之一[3]。泛素化修飾主要發(fā)生在賴氨酸殘基的側(cè)鏈,其過程是在泛素激活酶E1 和泛素結(jié)合酶E2 協(xié)同下,泛素連接酶E3 募集特異的靶蛋白和E2,并介導(dǎo)泛素與靶蛋白共價結(jié)合,形成多聚泛素鏈,26S 蛋白酶體隨后識別并降解帶有多聚泛素鏈的靶蛋白[4]。E3 泛素連接酶也可以通過單泛素化方式修飾靶蛋白,調(diào)節(jié)靶蛋白功能。當(dāng)E3 發(fā)生功能性突變時,其對靶蛋白的調(diào)控能力喪失可引起癌蛋白聚集、抑癌蛋白異常降解、細(xì)胞凋亡受阻或/和增殖加速,從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5-6]。
Figure 5. The apoptotic rate of HepG2 cells detected by flow cytometry. A:HepG2;B:HepG2-neo;C:HepG2-Lipo;D:HepG2-SIAH2.Mean±SD.n=3. * P <0.05 vs other groups.圖5 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率的變化
SIAH 是在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的一種E3 泛素連接酶家族成員,其C 末端為底物結(jié)合域(substrate binding domain,SBD),中間由2 個高度保守的的鋅指結(jié)構(gòu)域組成,N 末端含有40 ~80 個氨基酸殘基和典型的環(huán)指結(jié)構(gòu)域(ring finger domain)。人類SIAH2定位于染色體3q25,編碼324 個氨基酸[7]。研究發(fā)現(xiàn):胰腺癌和肺癌組織的中檢測到SIAH2 高表達(dá),且SIAH2 的表達(dá)水平與腫瘤的臨床病理分期和分化程度相關(guān);SIAH2 在BxPC3、Panc-1 等胰腺癌細(xì)胞及BZR、A549 等肺癌細(xì)胞中有高表達(dá);抑制SIAH2 可顯著抑制人胰腺癌或肺癌裸鼠皮下移植瘤的生長[8-9]。功能結(jié)構(gòu)域缺陷的SIAH2 或SIAH2 的RNA干擾載體可降低磷酸化ERK 的活性,抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn):SIAH2在肝癌組織中的表達(dá)陽性率高于相應(yīng)癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。SIAH2 表達(dá)水平與肝癌患者TNM分期具有相關(guān)性,與患者的性別、年齡、甲胎蛋白水平、腫瘤大小、血清HBsAg(hepatitis B surface antigen)水平和是否伴隨肝硬化不存在相關(guān)性[2]。上述研究結(jié)果提示,SIAH2 可能作為一個癌基因,在肝癌發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。
本研究中,我們將前期篩選到的特異性靶向SIAH2 的RNA 干擾載體pGenesil-SIAH2 轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,RT-PCR 和Western blotting 結(jié)果證實SIAH2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。MTS 結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pGenesil-SIAH2 的HepG2 細(xì)胞生長受到抑制。采用流式細(xì)胞術(shù)分析RNA 干擾對HepG2 細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期的影響,結(jié)果顯示pGenesil-SIAH2 轉(zhuǎn)染48 h 后,G1期細(xì)胞比例明顯高于其它組,提示沉默SIAH2 基因可阻止G1期細(xì)胞進入S 期,造成G1期細(xì)胞聚集,S 期細(xì)胞減少,從而抑制HepG2 細(xì)胞增殖[11]。
在凋亡的早期階段,分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè),從而被PS 特異的Annexin V 探針?biāo)鶚?biāo)記。將Annexin V 進行熒光素PE 標(biāo)記,利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12]。核酸染料7-AAD 對細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞是拒染的,而對膜完整性被破壞的晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞可以染色。因此,Annexin V-PE 結(jié)合7-AAD 雙染后,流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果呈現(xiàn)3 個細(xì)胞群,即左下象限(LL)正常細(xì)胞、右下象限(LR)早期凋亡細(xì)胞和右上象限(UR)晚期凋亡和壞死細(xì)胞。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)HepG2-SIAH2 細(xì)胞早期凋亡率較其它各組明顯升高。雖然凋亡早期細(xì)胞膜的完整性未遭到破壞,但胞內(nèi)早已啟動了凋亡機制,比如線粒體膜電位的喪失、細(xì)胞色素C 進入胞漿、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高以及啟動蛋白水解酶層疊級聯(lián)反應(yīng)等。凋亡晚期階段,細(xì)胞在蛋白水解酶等凋亡效應(yīng)分子的作用下,胞膜完整性遭到破壞,細(xì)胞皺縮,染色質(zhì)濃縮,DNA 裂解為長度不等的片段(180 ~200 bp 整倍數(shù)),最后形成由細(xì)胞膜包裹的凋亡小體并被其它細(xì)胞所吞噬。細(xì)胞處于壞死階段時,細(xì)胞腫脹直至破裂并釋放出內(nèi)含物,常引起炎癥反應(yīng)。因此,相對于晚期凋亡和壞死而言,早期凋亡能更靈敏地體現(xiàn)凋亡誘導(dǎo)因素作用下,細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生的一系列分子生物學(xué)事件。
綜上所述,利用RNA 干擾技術(shù)下調(diào)SIAH2 基因表達(dá)后,HepG2 細(xì)胞生長速度減慢,增殖受抑且凋亡率增加。接下來我們將建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型,探討SIAH2 作為肝癌基因治療靶點的可行性,為進一步闡明SIAH2 的分子生物學(xué)功能及其與肝癌發(fā)病的相關(guān)性,研制高效、特異的新型抗腫瘤藥物提供實驗依據(jù)。
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