慢病毒介導(dǎo)的降鈣素基因相關(guān)肽轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)皮分化的影響*

龍仙萍， 汪 松， 趙然尊， 石 蓓△， 敖竹君

(遵義醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1心內(nèi)科，2急診科，貴州 遵義563003;3曼尼托巴大學(xué)，加拿大曼尼托巴省溫尼伯市R3E 0J9)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是心肌缺血性壞死，為在冠狀動(dòng)脈病變的基礎(chǔ)上發(fā)生的冠脈血供急劇減少或中斷，使相應(yīng)心肌持久地急性缺血導(dǎo)致心肌壞死。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)雖可以挽救部分頻臨壞死的心肌細(xì)胞，但對(duì)長(zhǎng)期血供不足的心肌無(wú)明顯的作用。盡早恢復(fù)梗死區(qū)血液供應(yīng)是預(yù)防梗死后心功能衰竭，改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化潛能，多項(xiàng)研究顯示MSCs 移植后促進(jìn)梗死交界區(qū)毛細(xì)血管形成，從而改善梗死后心功能［1-2］。我們前期研究也顯示MSCs 移植于心肌梗死家兔可促進(jìn)梗死交界區(qū)毛細(xì)血管密度形成，使梗死面積縮小，心功能得到改善［3］。為了進(jìn)一步優(yōu)化MSCs 的移植作用，本課題前期應(yīng)用受體活性修飾蛋白1(receptor activity-modifying protein 1，RAMP1)修飾的MSCs 移植于心肌梗死后頸動(dòng)脈球囊損傷兔模型后，觀察到RAMP1 修飾的MSCs 移植較單純MSCs 移植更能促進(jìn)梗死交界區(qū)的毛細(xì)血管密度形成增加，更能改善梗死后心功能［4］。而RAMP1 是降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)肽，RAMP1 移植使CGRP 效應(yīng)增強(qiáng)，這說(shuō)明CGRP 對(duì)心血管的修復(fù)具有一定的作用。CGRP 是人體內(nèi)含量最豐富的神經(jīng)肽，對(duì)心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)CGRP 可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖［5］，還可以促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌一氧化氮(nitric oxide，NO)，改善內(nèi)皮的功能。那么CGRP 對(duì)MSCs 有無(wú)作用呢?為了觀察CGRP 的作用，本文利用慢病毒介導(dǎo)CGRP 基因轉(zhuǎn)染MSCs，觀察CGRP 對(duì)MSCs內(nèi)皮分化方面的作用及意義，以探討CGRP 是否促進(jìn)心肌梗死后的血管再生。

材 料 和 方 法

1 材料

10 只大鼠作為種子細(xì)胞的來(lái)源，雌雄不限，體重(150.0 ±0.1)g，鼠齡2 ～3 月，購(gòu)自遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)分為 CGRP 轉(zhuǎn)染 MSCs 組(CGRP)、CGRP 轉(zhuǎn)染MSCs + CGRP 受體拮抗劑組(CGRP+ CGRP8-37)及未經(jīng)轉(zhuǎn)染的對(duì)照組。前期實(shí)驗(yàn)應(yīng)用空慢病毒載體和PBS 轉(zhuǎn)染MSCs 后，觀察到兩者對(duì)細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞生物學(xué)特征無(wú)明顯影響，故本實(shí)驗(yàn)直接應(yīng)用PBS 轉(zhuǎn)染MSCs 作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)試劑:MaxGelTM細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和CGRP 受體拮抗劑CGRP8-37(Sigma);抗體(武漢博士德);基礎(chǔ)培養(yǎng)基:DMEM(Gibco);條件培養(yǎng)基:M199 含10%胎牛血清(PAA)、50 μg/L 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、5 μg/L 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、2 μg/L 胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(insulin-like growth factor I，IGF-I)、1 × 104U/L 的肝素、0.2%牛腦提取物、1 ×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素(Sigma)。

2 方法

2.1 大鼠MSCs 細(xì)胞的分離純化和培養(yǎng)擴(kuò)增 采用密度梯度離心法分離純化大鼠MSCs［3-5］。48 h 后換液，約10 ～14 d 細(xì)胞接近融合時(shí)按1∶3 傳代，標(biāo)記為第1 代(P1)，以后反復(fù)傳代擴(kuò)增。

2.2 攜帶CGRP 基因慢病毒載體的構(gòu)建 重組慢病毒Lenti-GFP-CGRP 和Lenti-GFP 均由上海英為信生物公司構(gòu)建，本實(shí)驗(yàn)用293 細(xì)胞擴(kuò)增，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 ELISA 檢測(cè)CGRP 表達(dá) 收集病毒轉(zhuǎn)染后1 d、2 d 和3 d 的細(xì)胞上清液，加入含Ⅰ抗的96 孔板，每孔加入100 μL 酶標(biāo)抗體工作液，封板，37 ℃孵育30 min，洗板后加底物工作液100 μL，置37 ℃避光反應(yīng)15 min 后加入100 μL 終止液混勻，30 min 內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)得450 nm 吸光度(A)，以標(biāo)準(zhǔn)品2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25、0 ng/L A 值為縱坐標(biāo)，根據(jù)樣品A 值在該曲線圖上查出CGRP 的含量。

2.4 大鼠MSCs 轉(zhuǎn)染CGRP 對(duì)細(xì)胞內(nèi)皮分化的影響

同源的P3 大鼠MSCs 用胰酶消化，按5 ×103cells/well 接種于預(yù)先放好細(xì)胞爬片的24 孔板，完全培養(yǎng)基過(guò)夜。12 h 后吸盡培養(yǎng)基，PBS 洗2 次，轉(zhuǎn)染組加人400 particles/cell Lenti-CGRP，CGRP +CGRP8-37組在給予Lenti -CGRP 前30 min 加入0. 1 μmol/L CGRP 受體拮抗劑CGRP8-37，對(duì)照組用PBS 代替。轉(zhuǎn)染后1 d、2 d、3 d 和4 d 在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)綠色熒光細(xì)胞并計(jì)算轉(zhuǎn)染率。每3 d 換液1 次，7 d 后取出爬片，進(jìn)行CD31 和Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細(xì)胞化學(xué)染色(SP 法)。

采用同源的P3 大鼠MSCs 用胰酶消化，按2 ×104cells/well 接種于24 孔板，完全培養(yǎng)基過(guò)夜12 h后吸盡培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)分組和步驟如上，分別在誘導(dǎo)后第1 d、2 d、3 d、5 d、7 d 和9 d 取出爬片進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，其余細(xì)胞每3 d 換液1 次。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果評(píng)估細(xì)胞增殖情況。

2.5 轉(zhuǎn)染CGRP 對(duì)大鼠MSCs 血管形成能力的影響

用4 ℃預(yù)冷的無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基按1∶5 的比例稀釋MaxGelTMECM，按50 μL/well 接種于96 孔板，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜。分組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，12 h 后以1 ×104cells/well，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行接種，實(shí)驗(yàn)分組和步驟如上，每組3 復(fù)孔。誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d 后鏡下觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)并拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0 軟件包分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，組間差異采用單因素方差分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠骨髓MSCs 的分離、培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

密度梯度離心獲得比較均一的球形單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)2 ～3 d 后首次換液，約7 ～10 d 細(xì)胞融合成單層，鋪滿瓶底。消化傳代后生長(zhǎng)較快，3 d 可鋪滿瓶。各組細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后增殖緩慢，有部分細(xì)胞死亡并脫落，而存活的細(xì)胞形態(tài)漸漸趨于均一，誘導(dǎo)后4 d 可見(jiàn)細(xì)胞由原來(lái)扁平多角形漸變?yōu)楸鈭A形、圓形或橢圓形，細(xì)胞狀態(tài)比較穩(wěn)定。經(jīng)EGFP 標(biāo)記的慢病毒轉(zhuǎn)染MSCs 后，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，細(xì)胞計(jì)數(shù)法所得細(xì)胞轉(zhuǎn)染率達(dá)80%，說(shuō)明Lenti-CGRP 成功地被轉(zhuǎn)入MSCs，見(jiàn)圖1。

Figure 1. Mesenchymal stem cells were cultured and transfected.A:primary cells cultured for 7 d (×40);B:passage cells (×100);C:untransfected cells (×100);D:cells transfected with Lenti-CGRP for 3 d (×100);E:cells transfected with Lenti-CGRP for 14 d，showing a cobblestone-like appearance (×100);F:untransfected cells showing a fiber-like appearance (×100).圖1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染圖片

2 ELISA 檢測(cè)CGRP 表達(dá)

CGRP 轉(zhuǎn)染MSCs 后1 d，培養(yǎng)基中有少量CGRP表達(dá)，CGRP 轉(zhuǎn)染后3 d，CGRP 蛋白明顯增加，與對(duì)照組比較有顯著差異［(19.530 ± 0.498)ng/L vs(3.120 ±0.001)ng/L，P ＜0.05］，說(shuō)明CGRP 成功轉(zhuǎn)染MSCs 后，MSCs 能分泌CGRP 蛋白，轉(zhuǎn)染后3 d達(dá)高峰。

3 轉(zhuǎn)染CGRP 對(duì)大鼠MSCs 內(nèi)皮分化的影響

SP 染色評(píng)估細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)咖啡色免疫復(fù)合物為陽(yáng)性細(xì)胞，隨機(jī)選取5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)后計(jì)算細(xì)胞陽(yáng)性率，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Lenti-CGRP 的MSCs細(xì)胞爬片CD31 染色大部分細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)(89.3%)，而加入CGRP 受體拮抗劑后CD31 的表達(dá)率下降(52.3%)，CGRP 組與CGRP +CGRP8-37及對(duì)照組比較差異顯著(P ＜0.05);CGRP 組Ⅷ因子相關(guān)抗原染色陽(yáng)性細(xì)胞率為65.2%，而加入CGRP 受體拮抗劑后Ⅷ因子相關(guān)抗原的表達(dá)率下降(35.3%)，CGRP 組與CGRP +CGRP8-37及對(duì)照組比較差異顯著(P ＜0.05)，見(jiàn)圖2。

4 轉(zhuǎn)染CGRP 對(duì)MSCs 增殖的影響

轉(zhuǎn)染CGRP 對(duì)誘導(dǎo)后MSCs 的增殖有影響，CGRP 組細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)很快，而對(duì)照組細(xì)胞增殖較慢，這種變化在細(xì)胞轉(zhuǎn)染CGRP 3 d 后最明顯(P ＜0.05)，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖速度無(wú)明顯增加。而加入CGRP 受體拮抗劑后上述細(xì)胞增殖現(xiàn)象明顯減弱，在轉(zhuǎn)染后3 d、5 d、7 d 和9 d 的細(xì)胞數(shù)量與CGRP 組相比有顯著差異(P ＜0.05)，見(jiàn)表1。這說(shuō)明CGRP 能增強(qiáng)并保持MSCs 向內(nèi)皮細(xì)胞分化后的干細(xì)胞增殖特性。

5 轉(zhuǎn)染CGRP 對(duì)MSCs 血管形成能力的影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后14 d，鏡下觀察到對(duì)照組MSCs 在纖維膠表面仍呈單層細(xì)胞纖維狀生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染Lenti-CGRP 后MSCs 呈環(huán)形及線性生長(zhǎng)，可發(fā)現(xiàn)血管管腔樣結(jié)構(gòu)，而加入CGRP 受體拮抗劑后MSCs 的這種環(huán)形及線性結(jié)構(gòu)減弱，見(jiàn)圖3。

討 論

血管再生治療是當(dāng)今缺血性疾病研究領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)，心肌梗死是臨床常見(jiàn)的一種嚴(yán)重的缺血性疾病，盡管目前臨床采用的冠狀動(dòng)脈介入治療和搭橋手術(shù)在很大程度上改善了心肌缺血，但對(duì)于急性和慢性冠狀動(dòng)脈狹窄閉塞引起的嚴(yán)重而持久的缺血，尤其是在無(wú)法實(shí)施手術(shù)治療時(shí)，其預(yù)后仍不理想。近年來(lái)，細(xì)胞移植治療雖在心肌梗死治療中取得了顯著的效果，但針對(duì)梗死后新生血管再生等方面的作用仍有限。如何提高干細(xì)胞移植效率，最大化的增加干細(xì)胞血管再生治療，有效恢復(fù)梗死后血流灌注是心肌梗死治療的關(guān)鍵。

Figure 2. Immunocytochemical staining for CD31 and factor Ⅷ-related antigen in rat MSCsing for (×400).圖2 大鼠MSCs CD31 及Ⅷ因子相關(guān)抗原的免疫細(xì)胞化學(xué)染色

表1 各組大鼠MSCs 增殖的比較Table 1. Comparison of the proliferation of rat MSCs in each group (×105.Mean±SD.n=3)

Figure 3. Angiogenesis of rat MSCs in different groups (×100).圖3 各組大鼠MSCs 管腔樣結(jié)構(gòu)形成圖片

CGRP 是人體內(nèi)含量最豐富的神經(jīng)肽，在心血管系統(tǒng)生理和病理調(diào)節(jié)中起了重要的作用。CGRP 注射大鼠缺血膝關(guān)節(jié)及缺血后肢，觀察到內(nèi)皮細(xì)胞增生明顯，血管形成增加，CGRP 受體拮抗劑作用后上述的作用明顯被抑制［6-7］。Zheng 等［8］的研究顯示，CGRP 通過(guò)調(diào)節(jié)cAMP-PKA 途徑促進(jìn)內(nèi)皮型一氧化氮合酶的合成。CGRP 還能促進(jìn)人表皮靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移［9］，而CGRP 轉(zhuǎn)染內(nèi)皮組細(xì)胞后，內(nèi)皮組細(xì)胞分泌的CGRP 能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖［10］。本課題前期研究顯示RAMP1 修飾的MSCs移植更能促進(jìn)心肌梗死后梗死交界區(qū)毛細(xì)血管形成，有效恢復(fù)梗死后血流灌注，改善梗死后的心功能。而RAMP1 是CGRP 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)肽，RAMP1 的作用結(jié)果與上調(diào)CGRP 的效應(yīng)性有關(guān)。那么CGRP究竟對(duì)MSCs 的有無(wú)作用呢?

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用攜帶CGRP 的慢病毒轉(zhuǎn)染MSCs 后，觀察到MSCs 在一定時(shí)間內(nèi)能分泌CGRP，轉(zhuǎn)染3 d后達(dá)高峰。對(duì)照組中隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，MSCs 自然分化為成纖維細(xì)胞，而轉(zhuǎn)染CGRP 后，細(xì)胞培養(yǎng)1周，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞樣特征，細(xì)胞呈典型“鋪路卵石樣”生長(zhǎng)，且CD31 和Ⅷ因子相關(guān)抗原染色呈陽(yáng)性，說(shuō)明MSCs 經(jīng)誘導(dǎo)干預(yù)可以定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞。增殖實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步體現(xiàn)了轉(zhuǎn)染CGRP 可增加MSCs 內(nèi)皮分化后的數(shù)量并保持干細(xì)胞的增殖能力;而轉(zhuǎn)染CGRP 的MSCs 中加入CGRP 受體拮抗劑后，上述作用明顯被抑制。在血管生成實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染CGRP 的細(xì)胞培養(yǎng)后14 d 呈環(huán)形、線狀生長(zhǎng)，加入CGRP 受體拮抗劑后環(huán)形、線狀結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)不明顯，而對(duì)照組細(xì)胞仍呈纖維樣排列。這說(shuō)明CGRP 作用MSCs 后可能更有利于調(diào)節(jié)微血管的發(fā)生。

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