蛋白激酶A 在慢性心房顫動患者2 型小電導(dǎo)鈣激活鉀通道調(diào)控中的作用*

張 麗， 李 濤， 李妙齡， 毛 亮， 譚曉秋， 楊 艷， 曾曉榮

(醫(yī)學(xué)電生理省部共建教育部重點實驗室，瀘州醫(yī)學(xué)院心血管醫(yī)學(xué)研究所，四川 瀘州646000)

心房顫動(atrial fibrillation，AF)是最常見且并發(fā)癥嚴重的心律失常之一。心房電重塑理論是近年來房顫機理研究中的核心內(nèi)容［1］。而動作電位時程則由心肌不同離子通道活動決定，因此研究AF 時離子通道的改變對AF 機制的闡明有重要意義。

小電導(dǎo)鈣激活鉀通道(主要為SK2 亞型)在心房表達豐富。文獻報道，AF 患者心房肌細胞內(nèi)鈣濃度升高［2］，且SK2 通道功能改變與AF 的發(fā)生和維持有關(guān)［3］;另一方面，SK2 通道鈣離子敏感性增加。此外，蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)參與了AF 時胞內(nèi)鈣循環(huán)紊亂的病理過程，且其對SK2 通道的調(diào)節(jié)作用在表達細胞和神經(jīng)系統(tǒng)得到充分證明［4-6］。因此，我們推測AF 時胞內(nèi)鈣超載可能影響SK2 通道功能，且PKA 通過一定途徑調(diào)節(jié)SK2 通道的活動。本文以人心房肌細胞為研究對象，就AF 時SK2 通道功能的改變及PKA 相關(guān)途徑對SK2 通道的調(diào)控機制進行了研究，旨在從細胞水平探討PKA 是否通過影響SK2 通道功能參與AF 電重構(gòu)過程。

材 料 和 方 法

1 標本來源

采用瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2011 年9 月至2012年9 月心胸外科行體外循環(huán)手術(shù)常規(guī)切除的患者右心耳組織為研究對象，其中竇性心律(sinus rhythm，SR)者作為對照組。本實驗得到瀘州醫(yī)學(xué)院倫理委員會的批準，所有試驗程序遵照國內(nèi)的相關(guān)法規(guī)和政策?；颊叩牟±Y料見表1。

2 試劑和藥品

V 型膠原酶、XXIV 型蛋白酶、白蛋白、HEPES、EGTA、?；撬帷⑾佘?、甘露醇、N-甲基谷氨酸(Nmethylglutamate，NMG)、β-羥丁酸、蜂毒明肽、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)和N-［2-(p-bromocinnamylamino)ethyl］-5-isoquinolinesulfonamide·2HCl hydrate(H-89)均購自Sigma，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1 人體心房肌細胞的分離 人心肌細胞急性酶分離采用改良的兩步法［7］。將心臟外科手術(shù)中切除的右心耳組織置于預(yù)先氧飽和的、冰凍的Cardiplegic液中，快速送往實驗室。首先將組織塊置于酶Ⅰ(蛋白酶1.22 ×104U/L，膠原酶1.5 ×105U/L，白蛋白1 g/L)中進行消化，于37 ℃恒溫水浴箱中持續(xù)充氧消化至鏡下可見一個完整心肌細胞，再將消化后的心耳組織置于酶Ⅱ(膠原酶1.5 ×105U/L，白蛋白1 g/L)于37 ℃恒溫水浴箱中持續(xù)充氧消化5 ～10 min，收集消化后的細胞懸液進行離心2 min (500 r/min)，棄上清液，KB 液保存細胞，置于4 ℃冰箱中備用，1 h 后用于電生理實驗。

表1 SR 組和AF 組患者臨床基本資料Table 1. The clinical characteristics of the patients in SR and AF groups (Mean±SD)

3.2 電生理實驗 顯微鏡下選擇呈桿狀、橫紋清楚的細胞進行電生理實驗。浴液(mmol/L):NMG 140，KCl 4，MgCl21，葡萄糖5，HEPES 10，pH 7.4)。實驗電極采用硬質(zhì)玻璃管，經(jīng)水平拉制機(P-97，Sutter)經(jīng)3 步拉制而成，電極尖端直徑為1 ～2 μm，充灌電極液(mmol/L:葡萄糖酸鉀144，MgCl21.15，EGTA 5，HEPES 10，游離鈣離子濃度為500 nmol/L，pH 7.4)后，電極阻抗約2 ～4 MΩ。實驗記錄采用EPC10 放大器、數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器和Patch-Master 進行通道電流的采集。實驗用常規(guī)膜片鉗全細胞記錄中的電壓鉗模式，采樣頻率20 kHz，低通濾波2 kHz，串聯(lián)電阻補償70% ～80%。高阻抗封接形成后阻抗達1 ～10 GΩ 時，在給予短促負壓吸破細胞膜，形成全細胞模式后可進行通道電流的記錄。刺激方案為:保持電位-60 mV，測試電壓從-130 mV到+60 mV，脈沖階躍為+10 mV，鉗制時間為200 ms ，見圖1A。膜片鉗實驗均在室溫下進行。

3.3 總蛋白及PKA 濃度測定 總蛋白濃度測定采用BCA 法。PKA 濃度的測定采用ELISA，人PKA ELISA 試劑盒購自RB(分裝)，檢測儀器采用Infinite M200 酶標儀(Tecan)。樣品準備方法為:將心臟外科手術(shù)中切除的心耳組織置于預(yù)先氧飽和的冰凍Cardiplegic 液中，快速送往實驗室。在冰上用PBS液清洗心耳組織，稱重，加入適量PBS(1 mg 組織+1 000 μL PBS +1 μL PMSF)，勻漿器將標本勻漿。4 ℃離心20 min (2 000 ～3 000 r/min)，取上清獲得組織總蛋白。PKA 的蛋白檢測嚴格按照ELISA 說明書進行操作。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

電生理數(shù)據(jù)采用Clampfit 10. 0 軟件(Axon Instruments)和Origin 8.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析作圖，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean ±SD)表示。組內(nèi)處理前后比較采用配對t 檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AF 時SK2 通道功能的改變

1.1 SR 組SK2 通道電流的特性 保持電位-60 mV，測試電壓從-130 mV 到+60 mV (10 mV 階躍)，記錄SR 組心房肌細胞的混合電流(圖1B);加入SK2 通道特異性阻斷劑蜂毒明肽(apamin;0. 1 μmol/L)后以同樣方法記錄電流(圖1C);相同測試電壓下，蜂毒明肽加入前后電流相減獲得蜂毒明肽敏感的電流，即SK2 通道電流(圖1D)。為排除細胞大小差異的影響，SK2 通道電流以電流密度(pA/pF)表示。該方法記錄的SR 組SK2 通道電流的電流-電壓關(guān)系呈現(xiàn)內(nèi)向整流特性(圖2A)。

Figure 1. The original recording of SK2 channel currents in SR (B ～D)and AF (E ～G)groups. A:the stimulation protocol of SK2 channel current recording;B，E:representative integrated inward currents obtained in human atrial myocytes before apamin treatment;C，F(xiàn):representative integrated inward currents obtained in human atrial myocytes after apamin (0.1 μmol/L)treatment;D，G:the apamin-sensitive SK2 channel currents in human atrial myocytes were obtained by digital subtraction.圖1 SR 組和AF 組SK2 通道電流記錄

1.2 AF 組SK2 通道電流的特性 同樣的方法記錄AF 組心房肌細胞SK2 通道電流(圖1E ～G)。記錄的AF 組SK2 通道電流的電流-電壓關(guān)系呈現(xiàn)內(nèi)向整流特性(圖2A)。本實驗記錄到的SR 組和AF 組SK2 通道電流特性與文獻報道一致。

1.3 AF 組SK2 通道功能改變 與SR 組相比，AF組心房肌細胞SK2 通道電流密度增大，在-130 mV、-120 mV、-110 mV、-100 mV、-90 mV 和-80 mV 測試電壓下，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖2A。在-130 mV 鉗制電壓下，SR 組和AF 組SK2通道電流密度分別為(-2. 61 ± 0. 14)pA/pF 和(-6.21 ±0.59)pA/pF(P ＜0.05)。這表明AF 發(fā)生后，SK2 通道電流明顯增強，這與本研究室之前的報道一致［8］。與SR 組相比，AF 組SK2 通道電流在混合電流中比例增加，在-130 mV、-120 mV、-110 mV、-100 mV、-90 mV 和-80 mV 測試電壓下，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖2B。在-130 mV鉗制電壓下，SR 組和AF 組SK2 通道電流占混合電流的比例分別為(20. 01 ± 1. 44)% 和(42. 87 ±1.79)%(P ＜0.05)。

2 PKA 選擇性抑制劑H-89 對SR 組和AF 組SK2通道功能的調(diào)節(jié)

2.1 H-89 對SR 組SK2 通道電流的調(diào)節(jié) 參照文獻，浴液中加入10 μmol/L H-89［9］，觀察藥物對電流的作用，繼續(xù)在浴液中加入蜂毒明肽。在相同測試電壓下，H-89 作用后的混合電流與加入蜂毒明肽后的混合電流相減，即為H-89 作用后的SK2 通道電流。經(jīng)統(tǒng)計分析，浴液中加入H-89 后，SR 組心房肌細胞SK2 通道電流密度減小，在-130 mV、-120 mV、-110 mV、-100 mV 和-90 mV 下電流密度減小的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0. 05)，見圖3A。在-130 mV鉗制電壓下，H-89 對SR 組SK2 通道電流的抑制率為(39.27 ±4.08)%。

2.2 H-89 對AF 組SK2 通道電流的調(diào)節(jié) 同樣的方法觀察H-89 作用后AF 組SK2 通道電流。浴液中加入H-89(10 μmol/L)后，AF 組心房肌細胞SK2 通道電流密度減小，在- 130 mV、- 120 mV、- 110 mV、-100 mV、-90 mV 和-80 mV 電壓下，電流密度減小的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖3B。在-130 mV 鉗制電壓下，H-89 對AF 組SK2 通道電流的抑制比為(76.32 ±2.94)%。

Figure 2. The alteration of SK2 channel currents in SR and AF groups. A:current densities of SK2 channel currents at different stimulating voltages;B:proportion of SK2 channel currents in the integrated inward currents.Mean±SD. * P ＜0.05 vs SR group.圖2 SR 組和AF 組SK2 通道電流的電流密度及在混合電流中的比例

2.3 H-89 對SR 組和AF 組SK2 通道電流調(diào)控的比較 與SR 組相比，H-89 對AF 組心房肌細胞SK2 通道電流密度的抑制率增大，在-130 mV、-110 mV、-100 mV 和- 90 mV 電壓下差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖4A。在-130 mV 鉗制電壓下，H-89 使SR 組和AF 組SK2 通道電流在混合電流中比例下降(P ＜0.05)，見圖4B;抑制率分別為(37.48 ±4.77)%和(56.40 ±3.66)%(P ＜0.05)，見圖4C。以上結(jié)果提示，PKA 選擇性抑制劑H-89 能夠調(diào)節(jié)SR 組和AF 組SK2 通道功能，且對AF 組SK2 通道功能調(diào)節(jié)作用更大。

3 PKA 對SK2 通道調(diào)控在AF 中作用

AF 組加入H-89 后與SR 組不加H-89 相比，SK2通道電流在混合電流中的比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖5，提示H-89 可以使蜂毒明肽敏感電流成分在房顫時的高水平恢復(fù)到竇性心律時的水平。

Figure 3. Effects of PKA-selective inhibitor H-89 on SK2 channel currents in SR (A;n=6)and AF (B;n=5)groups. Mean±SD.* P ＜0.05 vs without H-89.圖3 H-89 對SR 組和AF 組SK2 通道電流的影響

Figure 4. Comparison of the regulatory effect of H-89 on SK2 channel currents in SR and AF groups. A:inhibitory rates of SK2 channel current densities by H-89;B:proportion of SK2 channel currents in the integrated inward currents at -130 mV with or without H-89 treatment;C:inhibitory rates of proportion of SK2 channel currents in the integrated inward currents at -130 mV by H-89. Mean±SD. * P ＜0.05 vs SR group;#P ＜0.05 vs without H-89.圖4 H-89 對SR 組和AF 組SK2 通道電流調(diào)控的比較

Figure 5. The proportion of SK2 channel currents in the integrated inward currents in AF group with H-89 (n=5)and SR group without H-89 (n=5).Mean±SD.圖5 AF 組加入H-89 后與SR 組不加H-89 時SK2 通道電流占混合電流比例的比較

4 PKA 含量變化

心房組織PKA 濃度測定和總蛋白濃度測定的標準曲線R2＞0.99，線性關(guān)系好。AF 組的PKA 濃度與SR 組相比明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，見表2。

表2 SR 組和AF 組心房組織總蛋白和PKA 濃度Table 2. Levels of total protein and PKA in SR and AF atrial tissues (Mean±SD)

討 論

AF 是一種復(fù)雜的離子活動變化導(dǎo)致的功能性紊亂，其中胞內(nèi)鈣紊亂是導(dǎo)致房性心律失常的重要因素。心肌細胞在復(fù)極過程中對鈣特別敏感，因此受鈣調(diào)控的離子通道將明顯影響動作電位復(fù)極的變化。SK2 通道是鈣激活鉀通道在心房中的主要亞型，對胞內(nèi)鈣異常敏感(Kd＜0.5 μmol/L)，胞內(nèi)鈣輕微變化都對其功能產(chǎn)生明顯影響，且該通道主要在心房組織表達，因此成為目前AF 研究的熱點。

SK2 通道電流主要在心肌細胞復(fù)極末期發(fā)揮作用:SK2 通道特異性阻斷劑蜂毒明肽可導(dǎo)致心肌細胞動作電位末期明顯延長，且蜂毒明肽敏感的電流成分所起作用與動作電位期間胞內(nèi)Ca2+濃度的變化相平行，表明SK2 通道在人心肌細胞動作電位的復(fù)極期發(fā)揮著重要作用，且參與細胞內(nèi)鈣調(diào)控。Lu等［10］研究發(fā)現(xiàn)心肌細胞SK2 通道與L 型鈣通道(Ltype calcium channel，LTCC)通過α-肌動蛋白2 偶聯(lián)，LTCC 基因敲除的小鼠心房肌細胞SK2 通道蛋白表達降低，進一步證實SK2 通道的生理功能與胞內(nèi)鈣活動有關(guān)。

本實驗結(jié)果結(jié)合相關(guān)研究表明，在SR 組，SK2通道對維持心房正常電興奮發(fā)揮重要作用;本實驗顯示AF 時SK2 通道功能增強，細胞膜上的通道電流密度及在混合電流中成分增加。AF 時，SK2 通道電流增加可能與胞內(nèi)鈣超載有關(guān)。AF 疾病狀態(tài)下，心房電活動頻率增高引起大量鈣內(nèi)流，同時心房肌舒張期縮短引發(fā)鈣滲漏，肌漿網(wǎng)鈣儲備耗竭［11］，鈣不能充分從細胞內(nèi)移出及肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP 酶對鈣離子攝取障礙［12］，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣循環(huán)紊亂，發(fā)生鈣超載，從而激活SK2 通道。AF 時SK2 通道電流密度和在混合電流中比例增大，符合房顫的電重構(gòu)“AF begs AF”假說，即AF 的反復(fù)發(fā)作或連續(xù)電刺激導(dǎo)致心房肌有效不應(yīng)期進行性縮短、離散度增加、頻率適應(yīng)性下降、消失或者反向變化等。AF 時SK2 通道電流明顯增加，加速動作電位末期的復(fù)極，使動作電位時程縮短，參與細胞電重構(gòu)過程。外向K+電流的增多是導(dǎo)致動作電位縮短的重要機制，因此抑制SK2 通道電流的增加將減少房性快速性心律失常的發(fā)生。Diness 等［3］利用大鼠、狗和家兔的心臟在體及離體實驗證明了此觀點:應(yīng)用SK 通道特異性抑制劑UCL1684、ICA 和NS8593 可抑制SK 通道，延長心肌細胞的有效不應(yīng)期，但不影響QT 間期，可預(yù)防和終止AF 的發(fā)生。

此外，關(guān)于心肌細胞SK2 通道電流在AF 中的作用也有一些不同的觀點。有人認為SK2 通道電流密度及在混合電流中比例增加使動作電位復(fù)極加速，導(dǎo)致通道對K+通透性增加，K+外流增多，并在動作電位后引起后超極化，可以抑制動作電位的反復(fù)興奮，對維持細胞的正常生理功能具有重要作用。2009 年，Li 等［13］在完全敲除SK2 基因的小鼠模型上發(fā)現(xiàn)，心房肌細胞的動作電位時程明顯延長，特別是動作電位的末期延長，而動作電位的末期對異常興奮極其敏感，末期延長容易誘發(fā)觸發(fā)活動，導(dǎo)致AF的發(fā)生。此實驗的研究結(jié)果與經(jīng)典的AF 發(fā)生機制有悖，這可能是由于在生理狀態(tài)下，SK2 通道在動作電位復(fù)極后期發(fā)揮重要作用，而動作電位復(fù)極后期易于發(fā)生異常興奮所致。研究結(jié)果提示我們，SK2在心房肌上具有兩重作用:過分抑制能產(chǎn)生動作電位末期明顯延長而發(fā)生后除極電位，導(dǎo)致AF 的發(fā)生;過分上調(diào)使動作電位縮短，易產(chǎn)生折返，也能促成房性心律失常。本實驗中PKA 選擇性抑制劑H-89 使蜂毒明肽敏感電流在AF 時的高水平幾乎恢復(fù)到竇性心律時的水平，但H-89 同時也對SR 組蜂毒明肽敏感電流有明顯抑制作用，因此我們應(yīng)對SK2通道適度調(diào)控，才能真正使AF 得到有效的治療，從而減少副作用。

cAMP/PKA 信號系統(tǒng)是許多離子通道或轉(zhuǎn)運體信號通路調(diào)節(jié)的重要機制和環(huán)節(jié)。H-89 是PKA 選擇性抑制劑，廣泛應(yīng)用于PKA 信號系統(tǒng)對通道調(diào)節(jié)的研究。在心肌細胞中PKA 能夠通過磷酸化多種通道蛋白，包括LTCC、蘭諾定受體2 (ryanodine receptor 2，RyR2)、肌鈣蛋白I、肌球蛋白連接蛋白C 以及受磷蛋白(phospholamban，PLN)，參與心肌鈣循環(huán)的調(diào)控，維持心肌細胞正常生理功能。

心房肌細胞胞內(nèi)鈣超載是多種因素共同作用的結(jié)果。本實驗分別檢測SR 組和AF 組總蛋白和PKA 的濃度，結(jié)果顯示AF 時總蛋白濃度未發(fā)生明顯變化，但是PKA 的濃度是降低的，提示PKA 參與了AF 胞內(nèi)鈣循環(huán)紊亂的病理變化。PKA 參與AF 時胞內(nèi)鈣超載的發(fā)生，與多個通道及蛋白的異?；顒佑嘘P(guān)。Ramadan 等［14］研究表明AF 患者的心肌細胞內(nèi)，PKA 激活后通過磷酸化心肌細胞膜LTCC 通道活動增強，增加收縮期心肌細胞的鈣內(nèi)流，在AF 發(fā)生和維持中起重要作用。Vest 等［15］首次應(yīng)用犬快速起搏AF 模型及AF 患者的心房組織研究了RyR2 過度磷酸化在AF 發(fā)病機制中的作用，在起搏誘導(dǎo)的犬AF 模型中，PKA 介導(dǎo)的RyR2 過度磷酸化明顯增加，與RyR2 結(jié)合的FK506 結(jié)合蛋白12.6(FK506-binding protein 12.6，F(xiàn)KBP12.6)數(shù)量明顯減少，同時AF心肌細胞舒張期RyR2 的平均開放幾率明顯增加，開放時間延長，應(yīng)用RyR2 穩(wěn)定劑JTV-519 能夠促進AF 組FKBP12.6 與過度磷酸化的RyR2 結(jié)合，從而降低RyR2 的平均開放幾率;對慢性AF 患者心房組織的研究也得到了相似的結(jié)果。因此PKA 介導(dǎo)的RyR2 過度磷酸化所導(dǎo)致的肌漿網(wǎng)Ca2+滲漏可能與AF 的發(fā)生和維持有關(guān)。在人心肌細胞中，PKA 可導(dǎo)致RyR2 磷酸化，從而使FKBP12.6 與RyR2 發(fā)生分離，導(dǎo)致其開放概率和RyR2 對Ca2+的敏感性增加，進而導(dǎo)致肌漿網(wǎng)Ca2+儲備耗竭和舒張期Ca2+滲漏。此外，PKA 對PLN 磷酸化調(diào)節(jié)作用的異常，也參與了AF 時肌漿網(wǎng)鈣泄漏及胞內(nèi)鈣超載的發(fā)生［16］。AF 時胞內(nèi)鈣超載的發(fā)生是多因素共同作用的結(jié)果，PKA參與AF 時胞內(nèi)鈣超載的病理生理過程還可能與cAMP 改變有關(guān)，需進一步探索。

本實驗結(jié)果顯示，AF 時PKA 對SK2 通道功能發(fā)揮更大的調(diào)節(jié)作用，但在AF 的心房組織中PKA含量下降。結(jié)合文獻報道分析PKA 對AF 時心房肌細胞SK2 通道功能調(diào)控較強的原因:其一，PKA 直接作用于SK2 通道的功能亞基，調(diào)節(jié)通道對胞內(nèi)鈣離子的敏感性，從而調(diào)節(jié)其在心肌細胞中的生理功能。SK2 通道上存在多個PKA 磷酸化位點:位于胞內(nèi)N-端的Ser136和位 于C 端 的Ser465、Ser568、Ser569和Ser570。AF 時，PKA 增加SK2 通道對胞內(nèi)鈣離子的敏感性，從而使SK2 通道活動增加，電流增強。因而實驗結(jié)果表現(xiàn)為PKA 抑制劑H-89 對AF 組SK2 通道電流影響較大。其二，AF 時心房肌細胞內(nèi)PKA 活性發(fā)生變化，導(dǎo)致AF 時對SK2 通道磷酸化作用發(fā)生改變，影響SK2 通道生理功能。其三，PKA 通過磷酸化與胞內(nèi)鈣循環(huán)相關(guān)的通道蛋白，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣超載，從而間接增加鈣高度敏感的SK2 通道的開放概率，使AF 時SK2 通道電流上調(diào)。因此抑制PKA 對AF時相關(guān)通道蛋白有更明顯的影響，從而更明顯地抑制AF 時的SK2 電流。

本研究為探索AF 的機制及臨床治療提供了新的實驗依據(jù)。進一步研究PKA 的活性及其對心房肌細胞SK2 通道的磷酸化調(diào)控，可以深入了解PKA 在SK 通道調(diào)控及其在AF 發(fā)生機制中的作用。根據(jù)這些實驗結(jié)果，在后期研究中可將SK2 通道作為靶點篩選特異性作用于心房的藥物或基因治療的方法，維持SK2 通道的正常功能，為房性快速性心律失常的治療開辟新的途徑。

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