硫氧還蛋白硝基化在多柔比星誘導的乳鼠心肌細胞凋亡中的作用

王 斌， 李悅山

(廣州醫(yī)科大學藥理教研室，廣東 廣州510182)

多柔比星(doxorubicin，DOX)屬蒽醌類抗生素，是臨床上一種高效、廣譜抗腫瘤藥物，但其嚴重的心臟毒性限制了它的應用［1］。多柔比星心臟毒性的一個嚴重表現(xiàn)是誘導心肌細胞凋亡的發(fā)生［2］。研究發(fā)現(xiàn)，細胞內蛋白質硝基化修飾可以直接影響其生物學功能［3］，而多柔比星可以提高細胞內的蛋白質硝基化水平［4］。細胞內蛋白質的硝基化修飾是否是多柔比星誘導細胞凋亡的因素及其作用機制，目前尚無明確的報道。

硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)是生物體內廣泛存在的一種多功能小分子蛋白，因其在各個器官普遍存在且發(fā)揮重要作用而備受研究者的關注。臨床和動物研究發(fā)現(xiàn)Trx 活性與細胞凋亡密切相關。研究已經證實，硝基化修飾的Trx 活性降低，導致其抑制凋亡信號調節(jié)激酶1 (apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)活性的能力降低［5-7］，進而激活其下游信號通路。本實驗我們以多柔比星刺激心肌細胞模型，觀察心肌細胞Trx 硝基化水平的變化以及其對Trx-ASK1 等凋亡相關信號分子的影響，為揭示多柔比星心臟毒性和細胞凋亡的發(fā)生機制提供依據。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 主要試劑 多柔比星和細胞級二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購于Sigma;錳(III)四(1-甲基-4-吡啶基)卟啉［Mn(III)tetrakis(1-methyl-4-pyridyl) porphyrin，MnTMPyP］購于 Alexis;高 糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購于Gibco;MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、caspase-3 分光光度法檢測試劑盒和細胞凋亡熒光Hoechst 33258試劑盒購于南京凱基生物;蛋白定量試劑盒和發(fā)光液購于Pierce;Trx 和硝基酪氨酸(nitrotyrosine，NT)單克隆抗體以及ASK1 多克隆抗體購于Santa Cruz;聚ADP 核糖聚合酶1 剪切片段［cleaved poly(ADPribose)polymerase-1，PARP-1］、磷酸化ASK1 (p-ASK1)、p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)和磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)抗體購于Cell Signaling Technology。

1.2 動物 SPF 級Sprague-Dawley 新生大鼠(1 ～3 d，雌雄不限)由廣州中醫(yī)藥大學動物中心提供。

2 方法

2.1 心肌細胞分離培養(yǎng) 乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)方法參照Simpson 等［8］的方法改進而得。新生SD乳鼠用1%新潔爾滅洗凈后，在無菌超凈臺中打開胸腔，迅速取出左室心肌組織浸入冰冷的D-Hanks 液中，洗凈心室內血液，剪成(0.5 ～1)mm ×1 mm ×1 mm 大小的組織塊，沖洗數(shù)次;將剪碎的心肌組織轉移至錐形瓶中，加0.125%胰蛋白酶液3 ～4 mL，37℃恒溫磁力攪拌50 r/min，消化8 ～10 次，每次6 ～8 min。從第3 次消化起，收集上清(每次消化后，用吸管輕輕吹打30 s，靜置約2 min，用含30%新生牛血清的培養(yǎng)基終止消化，收集細胞)。1 500 r/min 離心10 min，棄上清。收集沉淀加入到含15% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中重懸細胞。將細胞懸液培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5% CO2水套式培養(yǎng)箱中差速貼壁2 h 后，小心吸出細胞懸浮液并計數(shù)。根據需要稀釋到一定密度(5 ×105～1 ×106/L)接種于培養(yǎng)皿(或孔板)中，24 h 后換為含15%胎牛血清加胰島素(10 mg/L)、轉鐵蛋白(10 mg/L)、維生素B12(1.5 μmol/L)和BrdU(0.1 mmol/L)的DMEM 培養(yǎng)基。96 h 后換用不含BrdU 的上述無血清培養(yǎng)基。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長的情況。細胞形成放射狀排列的細胞簇，呈同步性搏動，搏動細胞大于95%，則可進行以下實驗。

2.2 心肌細胞活力測定 參照南京凱基生物的MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒說明書，通過酶標儀550 nm 波長檢測吸光度值，計算心肌細胞的存活率。

2.3 細胞漿中caspase-3 活性的測定 參照南京凱基生物的caspase-3 分光光度法檢測試劑盒說明書，通過酶標儀405nm 波長檢測吸光度值，檢測caspase-3 的活化程度。

2.4 心肌細胞凋亡熒光顯微鏡觀察 參照南京凱基生物的細胞凋亡熒光Hoechst 33258 試劑盒說明書，熒光顯微鏡下，檢測細胞凋亡情況。

2.5 檢測Trx-ASK1 的分離和Trx-NT 的含量 用多克隆ASK1 抗體免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)法獲取細胞中的總ASK1，Trx 單克隆抗體Western blotting 檢測Trx-ASK1;用Trx 單克隆抗體IP 法獲取細胞內總Trx，NT 多克隆抗體Western blotting 檢測Trx-NT，具體方法參照Pierce 公司的IP 試劑盒說明書。

2.6 檢測cleaved PARP-1、p-ASK1( Ser967) 、p38 MAPK 和p-p38 MAPK 蛋白水平 提取細胞總蛋白后，BCA 法測定蛋白濃度，Bio-Rad 垂直電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃冰箱孵育1 抗(1∶1 000)，過夜，TBST 洗膜3 次，每次8 min，加Ⅱ抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，壓片法曝光成像。結果用ImageJ 圖像分析系統(tǒng)進行分析。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據用均數(shù)±標準差(mean ±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD 法)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 不同濃度多柔比星作用對細胞活力的影響

給予0、0.1、0.3、1、3 和10 μmol/L 多柔比星作用心肌細胞24 h 后，MTT 方法檢測細胞活力。1、3與10 μmol/L 多柔比星組MTT 值下降，與對照組比較均有顯著差異(P ＜0.05)，見圖1A。

2 胞漿caspase-3 活性的檢測

不同濃度多柔比星作用心肌細胞24 h 后，檢測胞漿caspase-3 活性。與對照組相比，1、3 和10 μmol/L 多柔比星組的caspase-3 活化度升高，分別為(171.53 ±18.25)%、(176.03 ±10.31)%和(187.00±18.39)%(P ＜0.05)，見圖1B。

3 Cleaved PARP-1 蛋白表達的檢測

多柔比星作用心肌細胞24 h 后，Western blotting檢測細胞內cleaved PARP-1 蛋白的表達。與對照組相比，1、3 和10 μmol/L 多柔比星組的cleaved PARP-1 表達明顯增加(P ＜0.05 或P ＜0.01)，見圖1C。

Figure 1. Effects of different concentrations of doxorubicin (DOX)on the viability and apoptosis of neonatal rat cardiomyocytes. A:cell viability;B:activity of caspase-3;C:expression of cleaved PARP-1 protein detected by Western blotting.Mean±SD.n=8 in A;n=3 in B and C. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol/L.圖1 不同濃度DOX 對心肌細胞活力和凋亡相關指標的影響

4 Trx 硝基化的檢測

多柔比星作用心肌細胞24 h 后，檢測細胞內Trx-NT 的表達。與對照組相比，1、3 和10 μmol/L 多柔比星組的Trx-NT 表達明顯增加(P ＜0.05)，見圖2。

Figure 2. Effects of different concentrations of DOX on the nitration of thioredoxin (Trx). NT:nitrotyrosine. Mean ±SD.n=3. * P ＜0.05 vs 0 μmol/L.圖2 不同濃度DOX 對Trx 硝基化的影響

5 不同濃度MnTMPyP 作用對細胞活力的影響

預孵育不同濃度MnTMPyP 2 h，再加1 μmol/L多柔比星，24 h 后檢測細胞活力。結果顯示，1 μmol/L 多柔比星組較對照組MTT 值下降(P ＜0.05)，30 和100 μmol/L 的MnTMPyP 可以顯著抑制多柔比星對細胞的損傷，與多柔比星組MTT 值比較有顯著差異(P ＜0.05)，見圖3A。

6 細胞凋亡熒光顯微鏡觀察

預孵育30 μmol/L MnTMPyP 2 h，再給予1 μmol/L 多柔比星，24 h 后進行Hoechst 33258 熒光染色。對照組細胞呈低藍色，多柔比星組細胞呈高藍色，亮度明顯增加，可觀察到明顯的細胞核固縮，具有凋亡的顯著特征;與多柔比星組相比，MnTMPyP組凋亡有所改善，見圖3B。

7 MnTMPyP 作用后caspase-3 活性的檢測

預孵育30 μmol/L MnTMPyP 2 h，再給予1 μmol/L 多柔比星作用心肌細胞24 h 后，檢測胞漿中caspase-3 的活性。相比于對照組，1 μmol/L 多柔比星組的caspase-3 活化度為(175.22±16.22)%(P ＜0.05);與多柔比星組相比，MnTMPyP 可以顯著抑制caspase-3的活化［126.30±9.62)%，P ＜0.05］，見圖3C。

8 MnTMPyP 作用后檢測cleaved PARP-1 的表達

預孵育30 μmol/L MnTMPyP 2 h，再給予1 μmol/L 多柔比星24 h 后，與對照組相比，多柔比星組cleaved PARP-1 表達明顯增加(P ＜0.01);與多柔比星組相比，MnTMPyP 可以明顯降低cleaved PARP-1 表達(P ＜0.05)，見圖3D。

Figure 3. Effects of MnTMPyP (MnT)on the viability and apoptosis of neonatal rat cardiomyocytes induced by DOX. A:cell viability;B:Hochest 33258 staining;C:activity of caspase-3;D:expression of cleaved PARP-1 detected by Western blotting.Mean±SD.n=8 in A;n=3 in B ～D. #P ＜0.05，##P ＜0.01 vs control;* P ＜0.05 vs DOX.圖3 MnTMPyP 對多柔比星誘導的心肌細胞活力和凋亡的影響

9 免疫沉淀法檢測Trx 硝基化程度

多柔比星作用24 h 后，與正常組比較，多柔比星組Trx 硝基化程度顯著增加(P ＜0.05);與多柔比星組相比，MnTMPyP+多柔比星組硝基化程度顯著降低(P ＜0.05)，見圖4A。

10 免疫沉淀檢測Trx 與ASK1 的結合程度

預孵育30 μmol/L MnTMPyP 2 h，再給予1 μmol/L 多柔比星作用24 h 后，多柔比星組與正常組比較Trx-ASK1 分離增多(P ＜0.05);與多柔比星組相比，MnTMPyP +多柔比星組Trx-ASK1 分離減少，見圖4B。

Figure 4. Effects of MnTMPyP(MnT)on nitration of Trx(A)and dissociation of Trx-ASK1(B)induced by DOX. NT:nitrotyrosine.Mean±SD.n=3. #P ＜0.05 vs control;* P ＜0.05 vs DOX.圖4 MnTMPyP 對多柔比星誘導的Trx 硝基化和Trx-ASK1 分離的影響

11 Western blotting 檢測細胞p-ASK1 (Ser967)

心肌細胞給予1 μmol/L 多柔比星作用24 h 后，與正常組比較，p-ASK1(Ser967)的表達顯著減少(P ＜0.05);與多柔比星組相比，MnTMPyP +多柔比星組p-ASK1(Ser967)表達顯著增加(P ＜0.05)，見圖5A。

12 Western blotting 檢測細胞p38 MAPK 的活化

心肌細胞給予1 μmol/L 多柔比星作用30 min后，與正常組比較，p-p38 MAPK 表達顯著增加(P ＜0.05);與多柔比星組相比，MnTMPyP +多柔比星組p38 MAPK 磷酸化程度顯著降低(P ＜0.05);各組之間p38 MAPK 的表達無顯著差異，見圖5B。

Figure 5. Effects of MnTMPyP (MnT)on the activation of ASK1 (A)and p38 MAPK (B)induced by DOX. Mean ±SD. n =3.#P ＜0.05 vs control;* P ＜0.05 vs DOX.圖5 MnTMPyP 對多柔比星誘導的ASK1 和p38 MAPK 活化的影響

討 論

本實驗應用多柔比星體外誘導乳鼠心肌細胞凋亡模型，觀察和探討此過程Trx 的硝基化情況以及凋亡相關信號分子的變化，為多柔比星導致的心肌損傷和細胞凋亡的具體機制提供依據。

多柔比星是一種蒽醌類抗生素，在臨床上是一種有效的廣譜抗腫瘤藥物，但是在臨床應用過程發(fā)現(xiàn)有很強的心臟毒性，可以導致各種心肌病甚至心力衰竭的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)多柔比星導致心肌細胞凋亡是心肌細胞流失和心功能失常很重要的一方面［9］。目前已有眾多關于多柔比星誘導心肌細胞凋亡機制的研究報道。線粒體功能紊亂，細胞內凋亡調節(jié)相關蛋白如P53 和Bcl-2 家族功能異常，血紅素加氧酶下調，細胞內caspases 募集反應凋亡抑制蛋白的表達降低等［9］，都與多柔比星的細胞毒性有關。但是多柔比星導致心肌細胞凋亡的具體機制目前尚未研究透徹。

眾多研究表明，多柔比星作用心肌細胞后，細胞內產生的大量氧自由基在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用［9-10］。這在我們前期的實驗也得到證實［11］。本實驗通過選取多柔比星0.1、0.3、1、3 和10 μmol/L 5個濃度梯度以觀察其對心肌細胞凋亡的影響。我們發(fā)現(xiàn)，多柔比星作用心肌細胞后，硝基化修飾的Trx明顯增加。Trx 硝基化后可導致其活性降低甚至喪失，抑制ASK1 的能力下降，進而導致ASK1 介導的凋亡的發(fā)生［12-14］。因此，Trx 的硝基化導致活性喪失可能是多柔比星導致心肌細胞凋亡的機制之一。過氧亞硝基陰離子被認為是蛋白硝基化修飾的重要因素［4］，我們選取了過氧亞硝基陰離子清除劑MnTMPyP作為保護劑，對Trx 的硝基化以及Trx-ASK1 等凋亡相關信號分子進行進一步探討。實驗證實MnTMPyP 可以降低多柔比星誘導的心肌細胞凋亡，細胞內的Trx硝基化形式含量顯著降低，caspase-3 和PARP-1 蛋白發(fā)生活化形式降低。降低Trx 硝基化可能是多柔比星誘導心肌細胞凋亡的途徑之一，多柔比星導致的Trx硝基化可能與細胞內產生ONOO-有關。

Trx 是細胞內一種重要的二硫鍵還原酶，對維持細胞內蛋白質的氧化還原狀態(tài)起著非常重要的作用。生物體內的Trx 系統(tǒng)包括Trx、Trx 還原酶(thioredoxin reductase，TrxR)、還原型輔酶II(NADPH)和Trx 過氧化物酶(thioredoxin peroxidase，TrxP)，這是一個控制細胞內氧化還原平衡狀態(tài)的重要的氧化還原酶系統(tǒng)。Trx 除了具有抗氧化作用外，還具有直接抗凋亡作用，其作用機制與細胞內的ASK1 密切相關［12-13］。ASK1 是絲裂原激活蛋白激酶激酶激酶家族(MAPKKK)中的一員，在凋亡信號中發(fā)揮著重要作用。p-ASK1 (Ser83)、p-ASK1(Ser967)發(fā)生去磷酸化或者p-ASK1(Thr845)發(fā)生磷酸化均可代表ASK1 的活化。ASK1 活化可以激活絲裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)家族中的MAPKK4、MAPKK7、MAPKK3 和MAPKK6，進而活化絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中c-Jun 氨基端激酶(JNK)和p38 這2 個促凋亡蛋白激酶。促凋亡蛋白激酶p38 與JNK 的活化會通過caspase 依賴途徑激活caspase-3 和PARP-1 的剪切致使PARP-1 失活導致細胞失去重要的DNA 修復功能而發(fā)生凋亡。還原型Trx 主要是通過Cys-32、Cys-35 的巰基與ASK1的N 端連接，通過抑制了ASK1 活性進而抑制細胞凋亡。我們以前的實驗已經證實給予多柔比星后，Trx 與ASK1 發(fā)生了分離可能是導致心肌細胞凋亡原因之一。多柔比星心臟毒性研究中發(fā)現(xiàn)，心肌細胞中蛋白質的硝基化形式明顯增加［4，15］。Trx 含有的酪氨酸殘基，在ONOO-大量產生時也可以發(fā)生硝基化修飾。Trx 硝基化失活是否參與多柔比星導致的凋亡，目前沒有詳細報道。對此，我們用多柔比星刺激心肌細胞進行實驗，免疫沉淀和免疫印跡法檢測Trx 硝基化，發(fā)現(xiàn)多柔比星刺激心肌細胞后，細胞內Trx-NT 表達明顯增加;Trx-ASK1 復合形式含量減少(P ＜0.05);利用p-ASK1(Ser967)抗體進行Western blotting 檢測，p-ASK1(Ser967)表達顯著減少(P＜0.05)，ASK1 發(fā)生了明顯活化;p-p38 MAPK 表達顯著增加(P ＜0.05)。多柔比星體外誘導心肌細胞凋亡過程中Trx-ASK1 分離增多，ASK1 活化，導致細胞凋亡的發(fā)生，這可能與Trx 硝基化修飾有關。使用ONOO-清除劑MnTMPyP 降低心肌細胞凋亡的過程中發(fā)現(xiàn)，Trx 硝基化程度減輕，Trx-ASK1 調節(jié)的凋亡相關信號分子受抑制，說明ONOO-清除劑MnTMPyP可以抑制多柔比星導致的Trx 硝基化修飾的增加。本文主要是探討多柔比星誘導心肌細胞凋亡過程中Trx 的硝基化水平與凋亡的關系。對于這一過程Trx硝基化的具體機制和途徑有待進一步探討。綜上所述，本實驗初步證實多柔比星誘導心肌細胞凋亡過程中，Trx 硝基化修飾可能是多柔比星誘導心肌細胞凋亡的機制之一，這可能與多柔比星刺激ONOO-的產生有關。本文探討的Trx 硝基化失活對凋亡的影響，將有助于進一步探討多柔比星心臟毒性以及心肌細胞凋亡具體機制的研究。

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