人乳腺癌組織中GATA3 的表達(dá)及其臨床意義*

黃 信， 蔣光愉， 李 虹， 龐 釗， 呂榮釗， 張 清， 何偉麗， 王寧霞△

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院1乳腺外科，2病理科，廣東 廣州510632)

GATA3 作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的遺傳分化方向。研究表明GATA3 與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并在不同乳腺癌亞型中所起的作用也有所不同［1］，目前在國(guó)外已將其作為分析乳腺癌分子生物學(xué)特點(diǎn)及判定預(yù)后意義的研究熱點(diǎn)，但相關(guān)研究結(jié)果尚存在爭(zhēng)議，國(guó)內(nèi)相關(guān)研究甚少。本研究采用免疫組化方法，檢測(cè)乳腺癌組織中GATA3 的表達(dá)，分析其與其它臨床病理指標(biāo)及其預(yù)后的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 材料

收集暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科自2008年2 月至2012 年2 月經(jīng)手術(shù)切除的乳腺癌石蠟組織標(biāo)本124 例，所有標(biāo)本均經(jīng)病理HE 染色及常規(guī)相關(guān)免疫組化染色，由本院2 位以上高年資病理醫(yī)師確診，均具有完整的術(shù)后病理資料。其中乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌82 例，浸潤(rùn)性小葉癌26 例，混合癌10 例，髓樣癌6 例。患者均為女性，年齡15 ～82 歲(平均年齡54 歲)。

2 主要儀器及試劑

GATA3 兔抗人多克隆抗體購(gòu)自CST，檢測(cè)濃度為1∶250;即用型GTVisionTM免疫組化檢測(cè)試劑盒(鼠兔通用)購(gòu)自廣州達(dá)科生物技術(shù)開發(fā)有限公司，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司;切片機(jī)為Thermo HM325 旋轉(zhuǎn)式顯微鏡用薄片切片機(jī)。

3 免疫組織化學(xué)染色

所有乳腺癌組織石蠟標(biāo)本經(jīng)切片機(jī)連續(xù)行4 μm 厚切片，免疫組化染色采用EnVision 兩步法。石蠟切片常規(guī)經(jīng)脫蠟后，將石蠟切片完全浸沒于0.01 mol/L pH 6.0 的枸櫞酸鹽緩沖液中，將其密閉放于微波爐中高溫加熱至沸騰后轉(zhuǎn)為低溫中持續(xù)加熱10 min，自然冷卻至室溫進(jìn)行熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)。切片經(jīng)PBS 洗滌后滴加I 抗兔抗GATA3 多克隆抗體(1∶250)，4 ℃溫育過夜。滴加即用型酶標(biāo)記的II 抗GTVisionTM，室溫濕盒中溫育30 min。DAB 顯色3 min，顯微鏡下觀察切面顯色情況以便及時(shí)阻斷，蘇木素襯染，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明后封片，光學(xué)顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照片為已知的陽(yáng)性表達(dá)片，陰性對(duì)照片為PBS 液代替I 抗進(jìn)行，每組每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陰性對(duì)照片。

4 結(jié)果的判定

4.1 GATA3 染色陽(yáng)性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn) 當(dāng)乳腺癌細(xì)胞胞核中出現(xiàn)深棕色及棕黃色染色則為GATA3陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選擇5 個(gè)高倍(×100)視野，按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞的百分比分類，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥20%為GATA3 表達(dá)陽(yáng)性切片，見圖1［2］。

Figure 1. GATA3 expression in breast cancer tissues detected by immunohistochemical staining.A:GATA3 negative expression (× 400);B:GATA3 positive expression(×100);C:GATA3 positive expression (×400).圖1 GATA3 在乳腺癌組織中表達(dá)的免疫組化染色

4.2 雌激素受體( estrogen receptor，ER) 、孕激素受體( progesterone receptor，PR) 和人表皮生長(zhǎng)因子受體2( human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) ER 陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色染色，≥10%即為ER 表達(dá)陽(yáng)性。PR 陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色染色，≥10%即為PR 表達(dá)陽(yáng)性。HER-2 陽(yáng)性判定:2007 年，美國(guó)臨床病理學(xué)協(xié)會(huì)和臨床腫瘤學(xué)會(huì)推薦HER-2 陽(yáng)性的定義標(biāo)準(zhǔn)是HER-2 免疫組化檢測(cè)+ + +(30%腫瘤細(xì)胞膜完全染色)或原位熒光免疫雜交檢測(cè)陽(yáng)性(HER-2 基因拷貝數(shù) ＞6 或HER-2/CEP17 ＞2.2)。交界性或不確定的HER-2 結(jié)果，F(xiàn)ish 評(píng)分為1.8 ～2.2 個(gè)基因/17 號(hào)染色體/細(xì)胞［3］。

4.3 乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)［4-5］根據(jù)2009年St.Gallen 專家共識(shí)對(duì)乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)分組。低危:淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移，且同時(shí)滿足以下6 個(gè)條件:標(biāo)本病灶大小≤2 cm，分級(jí)為1 級(jí)，脈管無(wú)癌栓，ER 和(或)PR 陽(yáng)性，HER-2 基因無(wú)過度表達(dá)或擴(kuò)增，年齡≥35 歲。中危:(1)淋巴結(jié)陰性，同時(shí)以下6 個(gè)條件至少具備1 個(gè):標(biāo)本病灶大?。? cm，分級(jí)為2 ～3級(jí)，有脈管癌栓，ER 和(或)PR 陰性，HER-2 基因過度表達(dá)或擴(kuò)增，年齡＜35 歲;(2)淋巴結(jié)1 ～3 個(gè)陽(yáng)性，ER 和(或)PR 陽(yáng)性且未見HER-2 基因過度表達(dá)。高危:(1)淋巴結(jié)1 ～3 個(gè)陽(yáng)性，ER 和PR 陰性或HER-2 基因過度表達(dá);(2)淋巴結(jié)≥4 個(gè)陽(yáng)性。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件陽(yáng)性率的比較，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，相關(guān)性分析采用Spearman 等級(jí)相關(guān)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 乳腺癌組織中GATA3 的表達(dá)與ER/PR 及其它相關(guān)臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系

乳腺癌組織中ER 陽(yáng)性組GATA3 的表達(dá)率為70.6%，而ER 陰性組GATA3 的表達(dá)率為25.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01);在PR 陽(yáng)性組中GATA3的表達(dá)率為69.7%，而PR 陰性組GATA3 的表達(dá)率為35.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01);相關(guān)分析顯示GATA3 與ER/PR 呈顯著正相關(guān)。另外，GATA3 低表達(dá)者與高組織學(xué)分級(jí)、脈管癌栓、p53 突變等表示預(yù)后較差的指標(biāo)相關(guān)(P ＜0.05)，但與HER-2表達(dá)、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡等因素?zé)o關(guān)(P ＞0.05)，見表1。

表1 乳腺癌組織中GATA3 表達(dá)與其它臨床病理指標(biāo)的關(guān)系Table 1. The relationship between GATA3 expression in breast cancer tissues and other clinicopathological factors

2 乳腺癌組織中GATA3 表達(dá)與乳腺癌分子分型的關(guān)系

目前乳腺癌的分子分型是對(duì)乳腺癌患者進(jìn)行個(gè)體化治療的基礎(chǔ)，在本實(shí)驗(yàn)中將所有乳腺癌分成Luminal 型乳腺癌(luminal A 型和luminal B 型)和非luminal 型乳腺癌(三陰型和HER-2 過表達(dá)型)，其中l(wèi)uminal 型乳腺癌86 例(69.4%)，非luminal 型乳腺癌38 例(30.6%)，其中在luminal 型乳腺癌中GATA3 陽(yáng)性表達(dá)58 例，表達(dá)率高達(dá)68.4%，而在非Luminal 型乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)12 例，表達(dá)率僅為32.6%，luminal 型乳腺癌與非luminal 型乳腺癌之間GATA 的表達(dá)有顯著差異(P ＜0.05)，見表2。這提示GATA3 高表達(dá)的乳腺癌對(duì)內(nèi)分泌治療敏感，惡性程度低，有較好的預(yù)后。

表2 GATA3 表達(dá)與乳腺癌分子分型的關(guān)系Table 2. The relationship between GATA3 expression and molecular subtypes of breast cancer

3 乳腺癌組織中GATA3 表達(dá)與乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)St.Gallen 共識(shí)將124 例乳腺癌進(jìn)行術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，其中中危組77 例(62.1%)，高危組40 例(32.2%)，在中危組中GATA3 表達(dá)率為63.6%，而在高危組中GATA3 的表達(dá)率為42.5%，中危組與高危組患者GATA3 的表達(dá)有顯著差異(P ＜0.05)，見表3。這提示GATA3 高表達(dá)者術(shù)后具有較高的無(wú)病生存率(disease-free survival，DFS)及總生存率(overall survival，OS)。

表3 GATA3 表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系Table 3. The relationship between GATA3 expression and recurrence risk after surgery

討 論

GATA3 是GATA 轉(zhuǎn)錄因子家族(GATA1 ～6)中的一員，它們以高親和力與(A/T)GATA(A/G)共同序列結(jié)合，共有一個(gè)類固醇激素受體超家族C4 鋅指結(jié)構(gòu)的DNA 結(jié)合基序，定位于染色體10p 15上［6］。GATA3 作為轉(zhuǎn)錄因子在正常乳腺組織中具有調(diào)節(jié)生長(zhǎng)和促進(jìn)分化的作用。Asselin-Labat 等［7］發(fā)現(xiàn)將GATA3 導(dǎo)入多能祖細(xì)胞(干細(xì)胞)中會(huì)引導(dǎo)其向?qū)Ч苌掀ぜ?xì)胞分化成熟，證實(shí)GATA3 是導(dǎo)管上皮細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Kouros-Mehr 等［8］發(fā)現(xiàn)敲除GATA3 的小鼠青春期開始后因乳腺組織不能形成末端乳牙，導(dǎo)管上皮組織無(wú)法侵入基質(zhì)而出現(xiàn)嚴(yán)重的乳腺發(fā)育缺陷。

Abba 等［9］證實(shí)，GATA3 表達(dá)與ER/PR 狀態(tài)密切相關(guān)，并與乳腺癌的組織學(xué)分級(jí)相關(guān)。本研究中GATA3 在ER/PR 陽(yáng)性組及低組織學(xué)分級(jí)中均呈高表達(dá)，且較ER/PR 陰性及高組織學(xué)分級(jí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Abba 等的研究結(jié)果一致。目前臨床上應(yīng)用常規(guī)病理免疫組化指標(biāo)將乳腺癌大致分為luminal A 型和luminal B 型、HER-2 過表達(dá)型和三陰型乳腺癌。大量的臨床研究數(shù)據(jù)已證實(shí)在乳腺癌的分子分型中，luminal A 型和luminal B 型乳腺癌預(yù)后較好，而三陰型和HER-2 過表達(dá)型乳腺癌預(yù)后較差。本研究根據(jù)ER、PR 和HER-2 表達(dá)情況，將乳腺癌分為luminal 型乳腺癌(luminal A 型和luminal B 型)和非luminal 型乳腺癌(三陰型和HER-2 過表達(dá)型)，通過比較兩組間GATA3 的表達(dá)情況知，GATA3 在luminal 型乳腺癌中高表達(dá)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GATA3 與ER/PR 間的關(guān)系仍在探討中，Wilson 等［10］發(fā)現(xiàn)GATA3 是構(gòu)成ER 信號(hào)通路所必需的，而luminal型乳腺癌高表達(dá)ER，說(shuō)明GATA3 的表達(dá)可能與luminal 型乳腺癌發(fā)生有關(guān)。Pei 等［11］發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子p18INK4c可以抑制通過抑制luminal 祖細(xì)胞增殖而抑制luminal 型乳腺癌的發(fā)生，而GATA3 能抑制p18INK4c的轉(zhuǎn)錄，減少INK4c 的產(chǎn)生，INK4c 低表達(dá)與GATA3 高表達(dá)往往同時(shí)存在于luminal 型乳腺癌中，但GATA3 的表達(dá)或過表達(dá)能否直接誘發(fā)luminal 型乳腺癌尚不明確［12］。

GATA3 在乳腺癌預(yù)后分析中的作用是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一，國(guó)外相關(guān)研究結(jié)果具有一些分歧。Jacquemier 等［13］發(fā)現(xiàn)，在240 例接受激素治療的ER 陽(yáng)性乳腺癌患者中，多因素分析顯示GATA3、血管癌旁浸潤(rùn)、Ki67、P53 的預(yù)后價(jià)值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Mehra等［14］發(fā)現(xiàn)，在預(yù)后很差的浸潤(rùn)性癌中GATA3 為主要的低表達(dá)蛋白之一，GATA3 低表達(dá)的腫瘤較高表達(dá)的腫瘤生存期明顯縮短。但Ciocca 等［15］在一項(xiàng)為期10 年的隨訪研究中發(fā)現(xiàn)，GATA3 陽(yáng)性和陰性的腫瘤之間復(fù)發(fā)率和生存率無(wú)顯著差異。而在ER 陽(yáng)性并接受內(nèi)分泌治療的患者中，GATA3 的表達(dá)具有中等強(qiáng)度的預(yù)后價(jià)值。在本研究中根據(jù)St.Gallen 共識(shí)將124 例乳腺癌分為低、中、高危組，中、高危組中GATA3 的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，由于GATA3 與一些預(yù)后較好的指標(biāo)相關(guān)，在luminal 型乳腺癌中高表達(dá)，且與ER/PR 陽(yáng)性表達(dá)高度相關(guān)，對(duì)臨床內(nèi)分泌治療具有指導(dǎo)價(jià)值，可以在一定程度上判定GATA3 陽(yáng)性患者預(yù)后好于GATA3 陰性。但其是否可以作為獨(dú)立的乳腺癌術(shù)后預(yù)測(cè)因子，仍需要更多的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)證實(shí)。

［1］ 謝軼群，裔海鷹，施俊義，等.GATA3 在乳腺癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系［J］.中國(guó)癌癥雜志，2010，20(12):911-914.

［2］ Sorlie T，Tibshirani R，Parker J，et al. Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100(14):8418-8423.

［3］ 蔣光愉，李 虹，何偉麗，等. 三陰型乳腺癌FOXA1和BRCA1 的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的意義［J］. 中國(guó)病理生理雜志，2012，28(7):1230-1234.

［4］ 江澤飛，王永勝. 2009 年第11 屆St. Gallen 國(guó)際早期乳腺癌治療研討會(huì):爭(zhēng)議與共識(shí)［J］. 中華乳腺病雜志:電子版，2009，3(4):381-386.

［5］ Goldhirsch A，Wood WC，Coates AS，et al. Strategies for subtypes-dealing with the diversity of breast cancer:highlights of the St Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011 ［J］.Ann Oncol，2011，22，(8):1736-1747.

［6］ 謝軼群，施俊義，李曦洲，等. GATA3 與乳腺癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，31(7):787-789.

［7］ Asselin-Labat ML，Sutherland KD，Barker H，et al.Gata-3 is an essential regulator of mammary-gland morphogenesis and luminal cell differentiation［J］. Nat Cell Biol，2007，9(2):201-209.

［8］ Kouros-Mehr H，Slorach EM，Sternlicht MD，et al. GATA-3 maintains the differentiation of the luminal cell fat e in the mammary gland［J］. Cell，2006，127(5):1041-1055.

［9］ Abba MC，Nunez MI，Colussi AG，et al. GATA3 protein as a MUC1 transcriptional regulator in breast cancer cells［J］. Breast Cancer Res，2006，8(6):R64.

［10］Wilson BJ，Giguère V. Meta-analysis of human cancer microarrays reveals GATA3 is integral to the estrogen receptor alpha pathway［J］. Mol Cancer，2008，7:49.

［11］Pei XH，Bai F，Smith MD，et al. CDK inhibitor p18INK4cis a downstream target of GATA3 and restrains mammary luminal progenitor cell proliferation and tumorigenesis［J］.Cancer Cell，2009，15(5):389-401.

［12］謝軼群，施俊義，李曦洲，等. GATA3 在乳腺癌組織中的表達(dá)及其與ER 表達(dá)的關(guān)系［J］. 中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2011，18(1):89-91.

［13］Jacquemier J，Charafe-Jauffret E，Monville F，et al. Association of GATA3，P53，Ki67 status and vascular peritumoral invasion are strongly prognostic in luminal breast cancer［J］. Breast Cancer Res，2009，11(2):R23.

［14］ Mehra R，Varambally S，Ding L，et al. Identification of GATA3 as a breast cancer prognostic marker by global gene expression meta-analysis［J］. Cancer Res，2005，65(24):11259-11264.

［15］Ciocca V，Daskalakis C，Ciocca RM，et al. The significance of GATA3 expression in breast cancer:a 10-year follow-up study［J］. Hum Pathol，2009，40(4):489-495.