從光肩星天?；铙w蟲中分離球孢白僵菌及其無紡布菌條生產(chǎn)

蒲順昌，劉玉軍，葛永斌，郭 慧

1.亳州師范高等專科學(xué)校理化系，安徽亳州，236800；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省微生物防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥，230036

光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)隸屬于昆蟲綱(Insecta)，鞘翅目(Coleoptera)，天?？?Cerambyeidae)，溝脛天牛亞科(Lamiinae)，星天牛屬(Anoplophora)[1]，是我國楊樹、柳樹等多種闊葉樹種的重要蛀干害蟲，是天?？浦邪l(fā)生較早的種類，分布于全國25個(gè)省、自治區(qū)，現(xiàn)已擴(kuò)展到世界多地[2-3]。柳樹是蚌埠市淮河堤壩的主要綠化樹種，但近年來受到光肩星天牛的嚴(yán)重危害，局部地區(qū)蟲口密度較大，危害面積有迅速擴(kuò)大之勢，嚴(yán)重影響了柳樹的正常生長。

昆蟲病原真菌具有不污染環(huán)境、易流行、容易大量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)[4]。球孢白僵菌Beauveriabassiana是昆蟲病原真菌中應(yīng)用最為廣泛的種類，據(jù)記載，該菌能侵染700余種昆蟲[5]。無紡布菌條是利用無紡布為載體，讓蟲生真菌在其上生長，當(dāng)害蟲在接觸無紡布上的孢子后即會(huì)受到侵染致死，從而達(dá)到防治害蟲的目的。徐金柱等研究表明，無紡布菌條能夠維持林間較高的帶菌量，并持久發(fā)揮作用[6]。為探討利用白僵菌防治光肩星天牛的有效途徑，本研究對(duì)從光肩星天?；铙w蟲中分離的球孢白僵菌進(jìn)行無紡布菌條的生產(chǎn)和檢測，為防治光肩星天牛提供新的技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

從蚌埠市淮河護(hù)堤柳樹林中采集光肩星天牛成蟲，并室內(nèi)飼養(yǎng)。經(jīng)過室內(nèi)分離鑒定，獲得10株球孢白僵菌菌株。

1.2 培養(yǎng)基

PPDA培養(yǎng)基(成分為馬鈴薯200 g，葡萄糖30 g，瓊脂20 g，酵母10 g，水1 000 mL)。SDAY培養(yǎng)基(成分為葡萄糖40 g，瓊脂20 g，酵母10 g，蛋白胨10 g，水1 000 mL)。

1.3 標(biāo)本分離與培養(yǎng)

將采集的昆蟲樣品用滅菌水沖洗3次后，放入0.1% 的升汞溶液中浸泡1 min，然后再用無菌水清洗3次。把經(jīng)表面消毒的蟲體，放入滅菌小塑料杯(25±1)℃保濕培養(yǎng)。為防止其他雜菌污染，將蟲體培養(yǎng)長出的真菌菌絲挑入含燕麥片(35 g)、瓊脂(5 g)、結(jié)晶紫(5 mg)、多果定可濕性粉(0.9 g)、青霉素(0.4 g)、鹽酸鏈霉素(1 g)、水(1 000 mL)的選擇性培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 標(biāo)本鑒定

觀察分離純化的菌株，記錄菌落的色澤、形態(tài)、生長速度等培養(yǎng)性狀，挑取少許菌株初產(chǎn)孢的培養(yǎng)物，用水溶液制成臨時(shí)玻片，在顯微鏡下觀察各菌株的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子形狀與大小。

1.5 無紡布菌條的培養(yǎng)制作及質(zhì)量檢測

1.5.1 無紡布菌條的培養(yǎng)制作

無紡布菌條的生產(chǎn)參照胡家付等[7]的方法。

1.5.2 含孢量的測定

任意抽取培養(yǎng)好的9條球孢白僵菌無紡布菌條，每3條為一組，分別為1組、2組和3組，在其上各剪下約1 cm2菌條，每條設(shè)3個(gè)重復(fù)。用無菌水將菌條上的分生孢子沖下，然后在高速分散器下分散10～15 min。用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)菌條上的平均產(chǎn)孢量。

1.5.3 孢子萌發(fā)率的測定

將上述孢懸液分別配成1.0×106個(gè)孢子/mL的孢懸液，然后接種于水瓊脂載玻片上，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。放入(25±1)℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后檢查其萌發(fā)率，統(tǒng)計(jì)出菌條上孢子平均萌發(fā)率。

1.5.4 含水率的測定

使用烘干法測定菌條含水率：從培養(yǎng)好的球孢白僵菌無紡布菌條中任意抽取9條，每3條為一組，在其上各剪下3小塊，放入120℃烘箱中烘1 h，比較烘干前后的重量，計(jì)算無紡布菌條的含水量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS18.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)方差分析后進(jìn)行Duncan's多重比較檢驗(yàn)各處理間的差異顯著性(P=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 光肩星天?；铙w成蟲病原微生物的鑒定

經(jīng)室內(nèi)分離培養(yǎng)，在自然狀況下，光肩星天牛感染病原微生物全部為球孢白僵菌，其形態(tài)特征如下：

球孢白僵菌在PPDA平板上(25±1)℃下培養(yǎng)14 d后，菌落生長較快，直徑達(dá)到4.5～5.0 cm。染菌蟲尸初為白色絨毛狀，后產(chǎn)生大量淡黃色粉狀分生孢子。分生孢子梗多著生于營養(yǎng)菌絲上，分生孢子濃密簇生分生孢子梗上，球形至瓶形，頸部軸上具明顯的“之”字形彎曲，在分生孢子?；蚓z上聚成緊密的孢子頭。分生孢子呈球形或近球形，透明并且光滑，2.0～3.0×1.6～2.5 μm。

2.2 白僵菌無紡布制劑的含孢量及活孢率的測定

按照前述方法制作無紡布制劑，干燥后進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)。隨機(jī)檢測白僵菌無紡布菌條含孢量，無紡布制劑的平均產(chǎn)孢量可達(dá)3.02×108個(gè)/cm2。Duncan極差分析顯示，各隨機(jī)樣品之間差異不顯著。對(duì)無紡布菌條活孢率進(jìn)行檢測，其菌條活孢率平均達(dá)到96.66%，各樣品間差異也不顯著(表1)。

2.3 白僵菌無紡布制劑含水率的測定

無紡布在保存期間要求較低的含水率，一般白僵菌菌條含水率在8%～10%之間。本研究檢測白僵菌無紡布制劑含水率為9.08%(表1)，達(dá)到無紡布制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，且有利于無紡布菌條的長期存儲(chǔ)。

表1 白僵菌無紡布菌條的產(chǎn)孢量、活孢率及含水量測定

注：表中數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；字母表示0.05水平上的差異顯著水平。

3 討 論

無紡布菌條具有極強(qiáng)的吸濕能力，能夠吸收大量的培養(yǎng)基營養(yǎng)成分，并在自然界自然降解，可以有效地改善白僵菌孢子生存環(huán)境，提高抵抗林間不良環(huán)境的能力，并可以在環(huán)境適宜的條件下促進(jìn)孢子的再次萌發(fā)、增加林間的帶菌量，以達(dá)到長期持續(xù)控制害蟲的目的[8]。Shimazu等[9]用培養(yǎng)有球孢白僵菌的無紡布菌條防治松褐天牛的幼蟲獲得了成功。目前，本研究制作的白僵菌無紡布菌條平均產(chǎn)孢量可達(dá)3.02×108個(gè)/cm2，經(jīng)菌條活孢率和含水量檢測，其菌條平均活孢率達(dá)到96.66%，含水量僅為9.08%，且各樣品間差異不顯著，可以達(dá)到野外防治的要求。

在野外調(diào)查過程中，并沒有發(fā)現(xiàn)感病的光肩星天牛僵蟲，所采集的光肩星天牛活蟲體是在室內(nèi)飼養(yǎng)過程中被白僵菌感染致死的，說明光肩星天牛在野外已經(jīng)感染球孢白僵菌。顯然，室內(nèi)適宜的環(huán)境條件，有利于白僵菌表現(xiàn)出癥狀。這表明本研究的球孢白僵菌在光肩星天牛種群中存在潛伏侵染現(xiàn)象。黃運(yùn)霞等[10]從廣西全境各經(jīng)緯線上采集活蟲樣品,分離蟲生真菌，結(jié)果表明，在所采集的活蟲樣品3 764份中，有蟲生真菌樣品334份，其平均檢出率為8.9%。表明蟲生真菌的潛伏侵染在自然界是非常普遍的現(xiàn)象，而且還可以通過寄主轉(zhuǎn)移，在林間宿存[11]。

從無紡布菌條的應(yīng)用方式來說，采用在每棵樹上均放置無紡布菌條的淹沒式的放菌方式，雖然可以取得一定的防治效果，且比較易于在山高坡陡灌叢密的森林中大面積應(yīng)用，但成本較高；而采用點(diǎn)狀的接種式放菌則是切實(shí)可行的[8]。為提高無紡布的防治效果，利用引誘劑結(jié)合無紡布菌條防治天牛類害蟲具有誘人的前景[9,12]。近年來，松褐天牛引誘劑和白僵菌結(jié)合使用已非常廣泛[13]。通過引誘劑的引誘聚集作用，增加昆蟲與球孢白僵菌孢子的接觸機(jī)會(huì)而提高天牛的感染率，同時(shí)也可增加林間的帶菌量。但至今還沒有光肩星天牛引誘劑的問世，下一步還需要進(jìn)行光肩星天牛高毒力菌株的篩選和引誘劑的開發(fā)，以便尋找簡便、有效、適用林間操作的防治方法，只有這樣，才能有效控制光肩星天牛的危害。

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