血管緊張素Ⅱ?qū)ρ芡饽こ衫w維細(xì)胞亞群增殖的影響

劉 培，邵鐵梅，李 雪，焦 展，溫 昕，仵 陶，安勝軍

(河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北省高校生物反應(yīng)器與蛋白類藥物開(kāi)發(fā)應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北石家莊 050026)

血管損傷后發(fā)生的管壁結(jié)構(gòu)重塑是血管重建術(shù)后再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化等多種心血管疾病發(fā)病的共同病理基礎(chǔ)。已有研究表明血管外膜并非僅起支撐作用，在血管損傷和高血壓中也起重要作用。特別是在某些刺激因子作用下，成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白，遷移至內(nèi)膜下區(qū)域和新生內(nèi)膜中并增殖，同時(shí)膠原合成增加，導(dǎo)致血管重構(gòu)［1］。因此，成纖維細(xì)胞的增殖、遷移及轉(zhuǎn)化在血管重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。本實(shí)驗(yàn)旨在比較在血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)刺激下，兩細(xì)胞亞群在增殖能力方面的異同，以期為研究其在血管重構(gòu)機(jī)制中的作用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí) ♂ SD大鼠，體質(zhì)量150～180 g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào):SCXK(冀)2008-1-003。

1.2 試劑 AngⅡ購(gòu)自Sigma公司;MTT購(gòu)自Solarbio公司;dNTP、TaqDNA聚合酶購(gòu)自Promega公司;所用引物由上海生工生物技術(shù)有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成。

1.3 方法

1.3.1 血管外膜成纖維細(xì)胞亞群培養(yǎng)與鑒定 方法同參考文獻(xiàn)［2］。

1.3.2 細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞亞群，用0.25%的胰酶消化成細(xì)胞懸液，以1.0×107·L－1接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μl，置培養(yǎng)箱中孵育24 h后，換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)過(guò)夜，使其生長(zhǎng)同步化，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組 Ang Ⅱ濃度依此為10、102、103nmol·L－1，每組6孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光度值(A值)。細(xì)胞增殖率/%=(實(shí)驗(yàn)組A值－對(duì)照組A值)/對(duì)照組A值×100%。

Tab 1 Effects of AngⅡon proliferation of adventitial fibroblast subpopulations

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞亞群純度鑒定 經(jīng)克隆環(huán)法獲得的成纖維細(xì)胞亞群和圓形細(xì)胞亞群不混有內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和白細(xì)胞，為純細(xì)胞系。

2.2 細(xì)胞亞群增殖活性分析 從Tab 1可看出，與自身對(duì)照相比，在10～103nmol·L－1范圍內(nèi)，AngⅡ?qū)杉?xì)胞亞群的增殖活性有不同程度的促進(jìn)作用，AngⅡ 102nmol·L－1對(duì)紡錘形細(xì)胞的增殖率高達(dá)19.9%(P＜0.01);而當(dāng)AngⅡ濃度增加時(shí)，對(duì)圓形細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用也更加明顯，增殖率分別為9.8%、23.3%(P＜0.01)、30.5%(P＜0.01)。這說(shuō)明AngⅡ?qū)杉?xì)胞亞群的增殖促進(jìn)作用存在差異。

3 討論

AngⅡ是腎素血管緊張素系統(tǒng)的一個(gè)重要效應(yīng)物質(zhì)。循環(huán)和局部自分泌或旁分泌的AngⅡ，通過(guò)其受體介導(dǎo)，引起血管收縮、血壓增高、交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮、醛固酮分泌促進(jìn)水鈉潴留，還致細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，細(xì)胞外基質(zhì)成分合成增加，促進(jìn)其它生長(zhǎng)因子和生物活性物質(zhì)釋放，在心肌、血管組織的病理性重構(gòu)、順應(yīng)性下降、功能失代償?shù)倪^(guò)程中起著重要作用［3］。之前的研究顯示兩細(xì)胞亞群的生長(zhǎng)特性略有不同［2］，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)AngⅡ?qū)喨旱脑鲋衬芰τ胁煌潭鹊拇龠M(jìn)作用，其中AngⅡ103nmol·L－1對(duì)紡錘形細(xì)胞亞群的增殖活性無(wú)明顯影響(增殖率6.8%，P＞0.05)，而對(duì)圓形細(xì)胞亞群的增殖作用有明顯促進(jìn)作用(增殖率30.5%，P＜0.01)。提示兩細(xì)胞亞群可能在血管重構(gòu)等病變中扮演不同角色，為研究AngⅡ?qū)杉?xì)胞亞群的增殖及轉(zhuǎn)化等作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

［1］Siow R C，Mallawaarachchi C M，Weissberg P L，et al.Migration of adventitial myofibroblasts following vascular balloon injury:insights fromin vivogene transfer to rat carotid arteries［J］.Cardiovasc Res，2003，59(1):212－21.

［2］劉 培，邵鐵梅，盧海剛，等.大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞亞群生長(zhǎng)特性及功能研究［J］.中國(guó)病理生理雜志，2012，28(1):47－52.

［2］Liu P，Shao T M，Lu H G，et al.Growth characteristics and function of rat vascular adventitia fibroblast subpopulations［J］.Chin J Pathophysiol，2012，28(1):47－52.

［3］張曉一，劉玉環(huán)，廖端芳，秦旭平.Losartan和CGRP對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖作用的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2006，22(1):101－5.

［3］Zhang X Y，Liu Y H，Liao D F，Qin X P.Effect of Losartan and CGRP on the proliferation of vascular smooth muscle cell induced by angiotensin Ⅱ［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(1):101－5.