紅車(chē)軸草總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

高蒙蒙，孫桂波，斯建勇，秦 蒙，羅 云，孟祥寶，王 敏，孫曉波

血管內(nèi)皮細(xì)胞與血管生理學(xué)的許多方面(如血管舒張、血管再生、炎癥和屏障功能等)密切相關(guān)，內(nèi)皮細(xì)胞損傷是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓的關(guān)鍵因素［1］。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的主要病理因素［2－3］，因而尋找具有抗氧化應(yīng)激作用的化合物對(duì)于治療心血管疾病具有重要的臨床意義。

紅車(chē)軸草中富含黃酮類(lèi)、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類(lèi)和維生素等多種成分，其中16種黃酮類(lèi)物質(zhì)已被檢測(cè)出，總含量占干重的2%［4］。具有潛在抗氧化作用的黃酮類(lèi)化合物是治療和預(yù)防心血管疾病的中草藥的主要有效成分。研究發(fā)現(xiàn)紅車(chē)軸草總黃酮(Red clover flavonoids，RCF)具有抗氧化作用［5］，且其中的芒柄花素、染料木素等可舒張動(dòng)脈血管，從而減少動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生［6］;血壓正常的絕經(jīng)期女人食入紅車(chē)軸草總黃酮(如芒柄花黃素等)可防治動(dòng)脈血管硬化并減少總血管阻力［7］，以上研究顯示紅車(chē)軸草總黃酮在預(yù)防和治療心血管疾病中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。紅車(chē)軸草來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉，具有明顯的新藥研發(fā)優(yōu)勢(shì)。但目前關(guān)于紅車(chē)軸草總黃酮對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304的方法，建立H2O2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304的氧化損傷模型，進(jìn)一步探究紅車(chē)軸草總黃酮對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)紅車(chē)軸草總黃酮治療心腦血管疾病提供實(shí)驗(yàn)資料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 紅車(chē)軸草總黃酮由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所化學(xué)室提供，用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解后保存?zhèn)溆?，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自 Gibco公司。LDH、SOD、MDA、CAT、GSH-Px試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所;H2O2購(gòu)于北京化工廠(chǎng);胰酶、四氮唑蘭(MTT)購(gòu)自SIGMA公司。

1.2 主要儀器 倒置顯微鏡(日本Olympus);超凈工作臺(tái)(上海智城分析儀器制造有限公司);酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek);離心機(jī)(中國(guó) Anke);細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo);熒光倒置顯微鏡(德國(guó)萊卡)。

1.3 方法

1.3.1 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304的培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株(內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304)由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。鏡下細(xì)胞呈“鋪路石”樣，多行性或短梭形鑲嵌排列。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí)，將瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液倒掉，PBS液輕洗細(xì)胞2～3次。加入1 ml左右0.125%胰酶，至37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育2 min，鏡下見(jiàn)細(xì)胞皺縮變圓、細(xì)胞間隙增大時(shí)，吸棄胰酶，加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液以終止胰酶的作用，用吸管反復(fù)輕輕吹打細(xì)胞，使之從瓶壁脫落成細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，接種于96孔板每孔 100 μl，置于 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。約 24 h后待細(xì)胞達(dá)融合狀態(tài)時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 H2O2誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的建立 內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304血管內(nèi)皮細(xì)胞以104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板。用無(wú)血清培養(yǎng)基將H2O2配成 0、75、150、300、600、800 μmol·L－1劑量組，分別加入96孔板中，每孔100 μl，分別作用12、24、48 h 后，將上清棄掉，每孔加入100 μl培養(yǎng)基和20 μl MTT(5 g·L－1)作用 4 h，將上清棄掉，每孔加150 μl DMSO，微孔振蕩器上振蕩 10 min，570 nm 酶標(biāo)儀下測(cè)細(xì)胞吸光度值(A)。細(xì)胞抑制率/%=(空白組吸光度值－各組吸光度值)(A)/空白組吸光度值(A)×100%

1.3.3 紅車(chē)軸草總黃酮對(duì)H2O2損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的時(shí)效關(guān)系研究 紅車(chē)軸草總黃酮用DMSO溶解，用量為每1 mg藥物加10 μl DMSO。內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304以104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，主要分以下兩組實(shí)驗(yàn):①紅車(chē)軸草總黃酮對(duì)正常內(nèi)皮細(xì)胞的影響:紅車(chē)軸草總黃酮用無(wú)血清DMEM溶解，并將其配制成 12.5、25、50 mg·L－13 個(gè)劑量，正常對(duì)照組每孔100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基，藥物組每孔100 μl含藥溶液，預(yù)孵育4 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。②紅車(chē)軸草總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用:正常對(duì)照組每孔加100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基，紅車(chē)軸草總黃酮 12.5、25、50 mg·L－1各劑量組分別預(yù)孵育2、4 h后，棄上清，加100 μl 300 μmol·L－1H2O2作用 24 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率/%=各組吸光度值(A)/空白組吸光度值(A)×100%。以確定紅車(chē)軸草總黃酮保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的最佳作用時(shí)間和作用濃度。

1.3.4 紅車(chē)軸草總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 將細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)分為5組，正常對(duì)照組(control):每孔給予2 ml無(wú)血清培養(yǎng)基;模型組(model):每孔給予 2 ml終濃度為 300 μmol·L－1H2O2，作用 24 h;紅車(chē)軸草總黃酮給藥組(RCF):給予2 ml終濃度為12.5、25、50 mg·L－1的紅車(chē)軸草總黃酮，孵育 4 h后，給予 2ml終濃度為 300 μmol·L－1H2O2作用 24 h。① 進(jìn)行H33342和PI染色:加入2 ml終濃度為1 g·L－1的 Hoechst33342 和 PI，37 度孵箱孵育 15 min，PBS洗3次，熒光倒置顯微鏡下觀(guān)察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué);②檢測(cè)細(xì)胞上清液中LDH的漏出量，細(xì)胞中SOD、CAT、GSH-Px的活力及 MDA的含量:收集各組上清以測(cè)LDH活力;消化收集各組細(xì)胞，每組加1 ml PBS，采取反復(fù)凍融的方法(－80°冰箱15 min，室溫20 min，如此重復(fù)5次)，至細(xì)胞破碎，內(nèi)溶物流出，3 000 r·min－1離心 10 min，吸取上清，進(jìn)行BCA蛋白定量，然后按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 MDA、SOD、CAT、GSH-Px的含量測(cè)定;③ 檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞Caspase-3活性:各組細(xì)胞經(jīng)藥物預(yù)孵育及H2O2損傷后，消化收集，計(jì)數(shù)并調(diào)整數(shù)目為1.5×106個(gè)/ml，加 50 μl Cell Lysis Buffer，冰上孵育 10 min，10 000 r·min－1離心1 min轉(zhuǎn)移上清到新管中，每個(gè)樣品加50 μl 2 ×Reaction Buffer(含終濃度 10 mmol·L－1的 DTT)，每個(gè)樣品再加 5 μl 4 mmol·L－1的DEVD-pNA(終濃度為 200 μmol·L－1)37℃ 孵育 1～2 h。405 nm分光光度計(jì)檢測(cè);④ 檢測(cè)總ROS產(chǎn)量:各組細(xì)胞經(jīng)藥物預(yù)孵育及H2O2損傷后，Hanks液清洗1次，然后用500 μl carboxy-H2DCFDA(25 μmol·L－1)于 37°C 避光條件下孵育 30 min，置于倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察;⑤檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位:將細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于24孔板，各組處理過(guò)程同上(加藥及H2O2體積為1 ml)，細(xì)胞經(jīng)藥物預(yù)孵育及H2O2損傷后，用 PBS清洗2次。加入10 μl 200 μmol·L－1(終濃度 2 μmol·L－1)JC-1 在避光條件下孵育30 min，再用PBS清洗兩遍后置于顯微鏡下觀(guān)察JC-1標(biāo)記的細(xì)胞，呈現(xiàn)綠色或橙紅色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以ˉ±s表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型的建立 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:細(xì)胞抑制率隨H2O2濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)150 μmol·L－1H2O2作用 48h 或 300 μmol·L－1H2O2作用 24 h(P＜0.01)時(shí)其細(xì)胞抑制率達(dá)50%左右，為理想造模條件。綜合考慮選用 300 μmol·L－1H2O2作用24 h作為最佳造模條件。結(jié)果如Fig 1所示。

Fig 1 Effects of different concentrations and incubation time of H2O2on ECV-304 cells

2.2 紅車(chē)軸草總黃酮單獨(dú)給藥對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響 紅車(chē)軸草總黃酮各劑量組(12.5、25、50 mg·L－1)預(yù)孵育4 h后細(xì)胞存活率分別為98.42% ±1.7%、97.60%±2.3%和97.71%±1.0%(ˉ±s，n=3)，正常對(duì)照組細(xì)胞存活率為100%±1.6%±s，n=3)，各給藥組與對(duì)照組相比差異沒(méi)有顯著性(P＞0.05)，表明紅車(chē)軸草總黃酮單給藥對(duì)正常內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304沒(méi)有損傷。

2.3 紅車(chē)軸草總黃酮對(duì)H2O2損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304的時(shí)效研究 紅車(chē)軸草總黃酮預(yù)孵育2、4 h 后，加300 μmol·L－1H2O2作用24 h，細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞活力明顯降低(P＜0.01);與模型組相比，槲皮素組和紅車(chē)軸草總黃酮(25、50 mg·L－1)組細(xì)胞活力明顯提高(P＜0.05，P＜0.01)，且紅車(chē)軸草總黃酮對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用呈劑量依賴(lài)性，與槲皮素組相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與藥物預(yù)孵育2 h相比，紅車(chē)軸草總黃酮及槲皮素預(yù)孵育4 h后細(xì)胞活力明顯提高(P＜0.01)。因而紅車(chē)軸草總黃酮的最佳預(yù)孵育時(shí)間為4 h。結(jié)果如Fig 2所示。

2.4 不同濃度紅車(chē)軸草總黃酮對(duì)H2O2損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304形態(tài)學(xué)影響 對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)目較多，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞呈多角形或短梭形、飽滿(mǎn)、大小一致;模型組的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞皺縮變圓，間隙增大;與模型組相比，紅車(chē)軸草總黃酮各劑量組細(xì)胞的形態(tài)均得到不同程度的改善，且呈劑量依賴(lài)性，大部分細(xì)胞呈多角形或短梭形，細(xì)胞間隙小，細(xì)胞皺縮明顯減少。表明紅車(chē)軸草總黃酮對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304具有良好的保護(hù)作用。結(jié)果如Fig 3所示。

Fig 2 Red clover flavonoids on endothelial cells in

Fig 3 Effects of RCF on morphological changes inH2O2-treated ECV-304 cells

Tab 1Effects of RCF on lipid peroxidation and anti-oxidant enzyme activity(ˉ±s，n=3)

Tab 1Effects of RCF on lipid peroxidation and anti-oxidant enzyme activity(ˉ±s，n=3)

Q30 represents quercetin 30 mg·L－1.##P ＜0.01 vs control;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model.

Group SOD/U·ml－1 MDA/nmol·ml－1protein LDH/U·L－1 CAT/U·mg－1protein GSH-Px/U·mg－1protein Control 17.33+0.092 5.64+0.093 319.4+6.18 28.38+0.23 80.03+0.64 Model 10.74+0.557## 7.60+0.189## 525.34+23.35### 16.42+0.88## 46.55+1.06##RCF(12.5 mg·L－1) 12.66+0.094* 6.89+0.057* 504.97+5.58 19.72+0.41* 51.65+1.53*RCF(25 mg·L －1) 15.41+0.214＊＊ 6.18+0.056＊＊ 464.04+5.01* 22.02+0.89* 60.85+1.24＊＊RCF(50 mg·L－1) 16.55+0.365＊＊ 6.03+0.118＊＊ 408.21+2.60＊＊ 24.43+1.22＊＊ 71.19+0.98＊＊Q(30 mg·L－1) 16.84+0.173＊＊ 5.72+0.131＊＊ 403.69+8.86＊＊ 25.61+1.27＊＊ 69.47+0.61＊＊

Fig 4 Effects of RCF on H2O2-induced ECV-304 cells apoptosis

2.5 紅車(chē)軸草總黃酮對(duì)H2O2損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304凋亡情況的影響 H33342及PI染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞核呈完整橢圓形，細(xì)胞數(shù)目多，幾乎無(wú)凋亡細(xì)胞;與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞核皺縮變形，細(xì)胞數(shù)目減少，凋亡細(xì)胞明顯增多;與模型組相比，RCF(12.5、25、50 mg·L－1)及槲皮素預(yù)孵育組細(xì)胞核形態(tài)較完整，細(xì)胞數(shù)目較多，凋亡細(xì)胞較少。且RCF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞抗H2O2損傷的作用具有劑量依賴(lài)性。結(jié)果見(jiàn)Fig 4。統(tǒng)計(jì)3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)照組、模型組、RCF 各劑量組(12.5、25、50 mg·L－1)的細(xì)胞凋亡率分別為 2.06% ±0.51%、33.92% ±1.35%、12.68% ±1.36、7%.96% ±0.88%和3.54%±0.80%(ˉ±s，n=3)，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞凋亡率升高(P＜0.001);與模型組相比，RCF各劑量組的細(xì)胞凋亡率降低(P＜0.01，P＜0.001)，說(shuō)明RCF預(yù)孵育可顯著降低細(xì)胞凋亡率而較好地保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。

2.6 不同濃度紅車(chē)軸草總黃酮對(duì)H2O2損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304酶活力的影響 與正常對(duì)照組相比，H2O2模型組加劇細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，LDH從內(nèi)皮細(xì)胞漏出增加，內(nèi)源性抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性降低，MDA含量升高。與H2O2模型組相比，RCF和槲皮素預(yù)孵育組LDH漏出量減少，SOD、CAT、GSH-Px活性升高，MDA 含量下降。結(jié)果如Tab 1所示。

2.7 不同濃度紅車(chē)軸草總黃酮對(duì)H2O2損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304線(xiàn)粒體膜電位的影響 統(tǒng)計(jì)3次線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)照組、模型組、RCF 各劑量組(12.5、25、50 mg·L－1)細(xì)胞的紅色熒光/綠色熒光的熒光強(qiáng)度比率分別為100% ±9.1%、65% ±6.2%、71% ±8.4%、83% ±9.7%、91%±7.7%(ˉ±s，n=3)。與對(duì)照組相比，模型組線(xiàn)粒體膜電位顯著降低(P＜0.01);與模型組相比，紅車(chē)軸草總黃酮各劑量組線(xiàn)粒體膜電位升高(P＜0.01)，且紅車(chē)軸草總黃酮各劑量組對(duì)線(xiàn)粒體膜電位的作用具有劑量依賴(lài)性。結(jié)果如Fig 5所示。

Fig 5 Effects of RCF on H2O2-induced mitochondrialtransmembrane potential in ECV-304 cells

2.8 紅車(chē)軸草總黃酮對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)水平的影響 根據(jù)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果得知，對(duì)照組、模型組、RCF 各劑量組(12.5、25、50 mg·L－1)細(xì)胞中 ROS陽(yáng)性細(xì)胞率分別為10% ±4.1、60% ±8.2、43% ±5.8、34%±6.9和22%±4.0(ˉ±s，n=3)。與對(duì)照組相比，模型組中ROS水平升高(P＜0.01);與模型組相比，預(yù)孵育不同濃度的紅車(chē)軸草總黃酮能夠抑制細(xì)胞內(nèi)由H2O2誘導(dǎo)的ROS高表達(dá)，使ROS水平降低(P＜0.01)，且呈劑量依賴(lài)性。結(jié)果如Fig 6所示。

Fig 6 Effects of RCF on intracellular ROSproduction in ECV-304 cells

2.9 紅車(chē)軸草總黃酮對(duì)H2O2損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304 caspase-3活性的影響 Caspase-3活性的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組中活化的Caspase-3水平升高(P＜0.001);與模型組相比，紅車(chē)軸草總黃酮(25、50 mg·L－1)預(yù)孵育組的 Caspase-3水平均有不同程度的降低，且紅車(chē)軸草總黃酮對(duì)Caspase-3活性降低的作用具有劑量依賴(lài)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅車(chē)軸草總黃酮抗凋亡作用可能與其調(diào)節(jié)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活有關(guān)。結(jié)果如Fig 7所示。

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因素［8］。活性氧自由基是內(nèi)皮細(xì)胞損傷的主要原因之一。H2O2是機(jī)體產(chǎn)生的活性氧，在過(guò)氧化條件下能分解成氧自由基，通過(guò)對(duì)生物膜中多不飽和脂肪酸的過(guò)氧化引起細(xì)胞損傷，最終形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。據(jù)此本實(shí)驗(yàn)建立了以H2O2為刺激因素的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型。

Fig 7 Caspase-3 activity(fold increase)of endothelial cells in different groups(ˉ ± s ，n=3)

脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有明顯的損傷作用，因此，具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力的藥物，也可達(dá)到防治動(dòng)脈粥樣硬化的目的。LDH是胞內(nèi)酶，漏出量的多少可反映細(xì)胞膜的受損程度;內(nèi)皮細(xì)胞MDA量的變化可反映內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ROS的情況［9］。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)存在一個(gè)包括SOD、CAT、GSH-Px等酶在內(nèi)的內(nèi)源性抗氧化體系，他們通過(guò)代謝轉(zhuǎn)化來(lái)清除ROS。GSH-Px氧化還原循環(huán)是內(nèi)皮細(xì)胞中最重要的H2O2-解毒體系［10］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，H2O2模型組內(nèi)皮細(xì)胞的LDH漏出量和MDA的含量顯著增加，而抗氧化酶(SOD、MDA、GSH-Px)的活性顯著降低，不能清除瞬間產(chǎn)生的大量的ROS，從而導(dǎo)致H2O2模型組的ROS水平升高，這一點(diǎn)與檢測(cè)ROS的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。而紅車(chē)軸草總黃酮的預(yù)作用可抑制H2O2的損傷作用，使LDH漏出量和MDA含量降低，內(nèi)皮細(xì)胞中SOD、CAT和GSH-Px的活力增強(qiáng)，胞內(nèi)ROS的水平降低，提示紅車(chē)軸草總黃酮可能是通過(guò)增強(qiáng)脂質(zhì)抗氧化酶活性而拮抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

線(xiàn)粒體在內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著核心的作用［11］。在線(xiàn)粒體調(diào)控的凋亡過(guò)程中最早期的變化就是線(xiàn)粒體膜的改變，這表現(xiàn)為線(xiàn)粒體跨膜電位的降低和線(xiàn)粒體膜通透性的改變［12］。本實(shí)驗(yàn)采用JC-1熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞的線(xiàn)粒體膜電位，結(jié)果顯示，模型組線(xiàn)粒體膜電位顯著降低，細(xì)胞凋亡比例顯著升高，這與模型組的PI染色凋亡統(tǒng)計(jì)結(jié)果一致。而紅車(chē)軸草總黃酮預(yù)處理組可抑制H2O2損傷引起的膜電位的降低，細(xì)胞凋亡比例降低，這種保護(hù)作用在RCF50 mg·L－1時(shí)最明顯，且具有劑量依賴(lài)性。結(jié)果表明紅車(chē)軸草總黃酮可能通過(guò)穩(wěn)定線(xiàn)粒體膜電位來(lái)發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮的作用。

氧化應(yīng)激可誘發(fā)Caspase-3及其他許多不同激酶的活化［13］，而Caspase-3是導(dǎo)致凋亡的最重要的凋亡執(zhí)行蛋白酶［14］。有研究表明，Caspase-3活化與H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡相關(guān)［15］。本實(shí)驗(yàn)中，模型組Caspase-3活性顯著升高，細(xì)胞大量凋亡，而紅車(chē)軸草總黃酮處理組可抑制H2O2引起的Caspase-3活性的升高，劑量依賴(lài)性減少凋亡細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果表明紅車(chē)軸草總黃酮通過(guò)抑制Caspase-3的活化而抑制細(xì)胞凋亡。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明H2O2可誘發(fā)ECV-304細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，而紅車(chē)軸草總黃酮預(yù)處理可抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。紅車(chē)軸草總黃酮的這種保護(hù)作用可能與其增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化性應(yīng)激系統(tǒng)、清除氧自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、降低Caspase-3的活性及穩(wěn)定線(xiàn)粒體膜電位有關(guān)。

近年來(lái)研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損害是心血管疾病早期的重要特征，是促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化最重要的始動(dòng)因素［16］，因而尋找抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能的藥物是防治心血管疾病的重要思路。本實(shí)驗(yàn)雖然對(duì)紅車(chē)軸草總黃酮對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制做了初步探究，但仍需進(jìn)行大量的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步深入研究藥物作用機(jī)制，才能為其在臨床的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供可靠的科學(xué)依據(jù)，并有望將其開(kāi)發(fā)成新的臨床治療心血管疾病的藥物。

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