RP-HPLC法測(cè)定注射用磷酸肌酸鈉有關(guān)物質(zhì)的含量

郭興輝，王倩雯（1.河南省食品藥品檢驗(yàn)所，鄭州450000；.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣州516000）

磷酸肌酸鈉是一種心肌保護(hù)劑，臨床上用于治療橫紋肌活性不足，是心肌疾病的輔助治療藥物[1]。2010年版《中國(guó)藥典》二部未收載該原料藥及制劑，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于進(jìn)口藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，且僅對(duì)其總雜質(zhì)的量進(jìn)行了控制，在其他文獻(xiàn)中未見(jiàn)有關(guān)磷酸肌酸鈉有關(guān)物質(zhì)的報(bào)道。為更好地控制藥品質(zhì)量，本文建立了反相（離子對(duì)）高效液相色譜（RP-HPLC）法測(cè)定注射用磷酸肌酸鈉中已知雜質(zhì)肌酸、肌酸酐和磷酸肌酸酐的含量。經(jīng)方法學(xué)考察，線性關(guān)系良好、專屬性好、回收率滿意，且操作快速、結(jié)果準(zhǔn)確，同時(shí)對(duì)其他有關(guān)物質(zhì)也進(jìn)行了控制[2]。表明所建立的方法適用于該原料藥合成及制劑分裝前生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量控制。

1 材料

2695 HPLC儀、2996二極管陣列檢測(cè)器（PDA）、Empower色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；AE-240電子分析天平（上海梅特勒-托利多公司）。

注射用磷酸肌酸鈉（由某公司提供，批號(hào)：20111211、20111221、20111231，規(guī)格：每瓶0.5 g）；肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐、磷酸肌酸鈉對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為：100876-200901、100877-200901、C1413、100875-200901，純度分別為：99.7%、99.2%、97.8%、76.2%）；四丁基磷酸氫銨為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.005 mol/L四丁基磷酸氫銨溶液（取四丁基磷酸氫銨1.7 g，加水900 ml使溶解，用20%磷酸鈉調(diào)節(jié)pH值至7.0，用水稀釋至1000 ml），流速：1.0 ml/min；溶劑：水；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μl。理論板數(shù)按磷酸肌酸鈉峰計(jì)為7854。

2.2 空白試驗(yàn)

注射用磷酸肌酸鈉由磷酸肌酸鈉原料藥無(wú)菌分裝制成，沒(méi)有輔料添加，因此，取有關(guān)物質(zhì)測(cè)定時(shí)溶解樣品的溶劑10 μl，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果溶劑不干擾樣品中肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐和其他有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定，見(jiàn)圖1。

2.3 肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐線性關(guān)系考察

取肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成含肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐50、50、100 μg/ml的混合溶液，分別稀釋成不同質(zhì)量濃度（肌酸、肌酸酐為10、25、50、75、100、125 μg/ml，磷酸肌酸酐為20、50、100、150、200、250 μg/ml）溶液注入色譜儀，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得回歸方程分別為：肌酸：y＝915.69x+5.6519（r＝0.9999，n＝5）；肌酸酐：y＝2664.5x－4.7182（r＝0.9999，n＝5）；磷酸肌酸酐：y＝1117.6x+4.8245（r＝0.9999，n＝5）。結(jié)果表明，肌酸、肌酸酐檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為10～125 μg/ml；磷酸肌酸酐檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為20～250 μg/ml。

2.4 檢測(cè)限和定量限

取“2.3”項(xiàng)下的混合溶液及磷酸肌酸鈉對(duì)照品溶液稀釋后進(jìn)樣，當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐、磷酸肌酸鈉檢測(cè)限分別為0.5、0.25、2.0、0.5 ng；當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，定量限分別為1.0、0.5、1.5、1.0 ng。

圖1 磷酸肌酸鈉專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖A.溶劑；B.未經(jīng)破壞樣品；C.酸破壞樣品；D.堿破壞樣品；E.高溫破壞樣品；F.氧化破壞樣品；G.光破壞樣品；1.磷酸肌酸鈉Fig 1 HPLC chromatograms of specificity test of creatine phosphate sodiumA.solvent；B.undestroyed samples；C.samples destroyed by acid；D.samples destroyed by alkali；E.samples destroyed by high temperature；F.samples destroyed by oxidation；G.samples destroyed by high light；1.creatine phosphate sodium

2.5 精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下混合溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)算RSD，結(jié)果分別為肌酸：0.33%，肌酸酐：0.17%，磷酸肌酸酐：0.61%，表明該方法精密度良好。取上述溶液，在2～8℃溫度條件下，分別于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣，測(cè)定肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐峰面積，結(jié)果RSD分別為0.60%、0.88%、1.32%，表明混合溶液在2～8℃溫度條件下10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 回收率試驗(yàn)

取供試品（批號(hào)：20111211）約50 mg，共9份，精密稱定，分別加入肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐混合溶液（500、500、1000 μg/ml）0.8、1.0、1.2 ml各3份，置于10 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；取10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，外標(biāo)法計(jì)算含量及回收率。結(jié)果，肌酸的平均回收率為100.9%，RSD＝1.3%；肌酸酐平均回收率為99.2%，RSD＝1.2%；磷酸肌酸酐平均回收率為99.8%，RSD＝0.8%。表明該方法準(zhǔn)確度良好，基本滿足肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐的測(cè)定要求，詳見(jiàn)表1、表2、表3。

2.7 專屬性試驗(yàn)

取供試品（批號(hào)：20111211）約50 mg，共6份，進(jìn)行不同條件下的降解試驗(yàn)，試驗(yàn)條件分別為：（1）未經(jīng)破壞；（2）酸破壞：加入0.1 mol/L的鹽酸溶液2 ml，室溫放置20 min后用堿中和；（3）堿破壞：加入0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液2 ml，室溫放置20 min后用酸中和；（4）高溫破壞：樣品在120℃烘箱中放置1 h；（5）氧化破壞：加入30%的雙氧水0.5 ml，室溫放置20 min；（6）光破壞：在1500 lx的強(qiáng)光下照射12 h。以上樣品均用水溶解制成5 mg/ml的溶液，搖勻，測(cè)定。結(jié)果，所有降解產(chǎn)物與主峰的分離度均符合要求，表明該方法的專屬性較強(qiáng)，色譜見(jiàn)圖1。

表1 肌酸回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1Results of recovery test of creatine（n＝9）

表2 肌酸酐回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2Results of recovery test of creatinine（n＝9）

表3 磷酸肌酸酐回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 3Results of recovery test of creatinine phosphate（n＝9）

2.8 樣品中肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐及其他有關(guān)物質(zhì)的含量測(cè)定

3種已知雜質(zhì)采用對(duì)照品對(duì)照法計(jì)算含量，有關(guān)物質(zhì)采用主成分自身對(duì)照法計(jì)算含量。取供試品適量，加水溶解并制成5000 μg/ml的溶液作為供試品溶液；將供試品溶液稀釋成50 μg/ml的溶液作為對(duì)照溶液；取肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐對(duì)照品適量，加水溶解制成50、50、100 μg/ml的溶液作為對(duì)照品混合溶液。進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖至主峰保留時(shí)間的2倍。結(jié)果，供試品溶液和對(duì)照品混合溶液色譜見(jiàn)圖2，數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

3.1 波長(zhǎng)的選擇

圖2 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定高效液相色譜圖A.供試品溶液；B.對(duì)照品混合溶液；1.肌酸；2.肌酸酐；3.磷酸肌酸酐Fig 2 HPLC chromatograms of related substance testsA.test sample solution；B.mixed solution control；1.creatine；2.creatinine；3.creatinine phosphate

表4 3批樣品中有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果（%%）Tab 4 Results of content determination of related substance in 3 batches of samples（%%）

采用本文選定的色譜條件，分別對(duì)流動(dòng)相、溶劑、磷酸肌酸鈉對(duì)照品、肌酸對(duì)照品、肌酸酐對(duì)照品、磷酸肌酸酐鈉對(duì)照品采用PDA檢測(cè)。結(jié)果，肌酸、肌酸酐、磷酸肌酸酐、磷酸肌酸鈉的最大吸收波長(zhǎng)均為210 nm，因此選定210 nm為有關(guān)物質(zhì)檢查的檢測(cè)波長(zhǎng)。綜合HPLC-PDA檢測(cè)和專屬性試驗(yàn)結(jié)果可以看出，磷酸肌酸鈉及其雜質(zhì)在210 nm波長(zhǎng)處均可以檢出，試驗(yàn)溶液在各種破壞條件下有關(guān)物質(zhì)均能有效檢出，主峰與雜質(zhì)峰之間能夠良好地分離。因此，選擇210 nm作為有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)波長(zhǎng)能有效檢出雜質(zhì)，未漏檢雜質(zhì)峰。

3.2 流動(dòng)相的選擇

分別采用0.04、0.05、0.06 mol/L的四丁基磷酸氫銨溶液，并分別調(diào)pH為6.8、7.0、7.2，在25、30、35 ℃的柱溫條件下，對(duì)磷酸肌酸鈉進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相濃度為0.05 mol/L、pH值為7.0、柱溫為30℃時(shí)，磷酸肌酸鈉峰的保留時(shí)間合適，峰形好，柱效高。同時(shí)對(duì)不同品牌的色譜柱進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)Waters C18柱較Diamonsil C18柱分離效果好、耐用性強(qiáng)。故選作本文的色譜條件進(jìn)行分析。

3.3 溶液穩(wěn)定性

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，制備好的溶液在室溫放置時(shí)，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，磷酸肌酸鈉峰面積隨之減小，有關(guān)物質(zhì)的含量相應(yīng)增加，對(duì)含量和有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果影響較大。故建議制備好的溶液于2～8℃溫度條件下保存[3]，且宜臨用新配。

綜上，本文建立的方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)，可用于注射用磷酸肌酸鈉中有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量控制。

[1]王汝衛(wèi).磷酸肌酸的藥理與臨床應(yīng)用[J].首都醫(yī)藥，1999，6（5）：32.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：172-176.

[3]祁廣建，沈國(guó)英，王毅，等.離子對(duì)色譜法測(cè)定磷酸肌酸鈉的穩(wěn)定性[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2004，24（1）：11.